ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Двостороння зварена труба для хімічної промисловості хімічний компонент. Дефіцит SPECC1L призводить до підвищення стабільності зрощених з’єднань і зменшення відходження клітин черепного нервового гребеня.

Дякуємо, що відвідали Nature.com.Ви використовуєте версію браузера з обмеженою підтримкою CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Крім того, щоб забезпечити постійну підтримку, ми показуємо сайт без стилів і JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Дуплексна зварна труба для хімічної промисловості

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.є провідним виробником, який спеціалізується на безшовних трубах з нержавіючої сталі, яскраво відпалених трубах, безшовних спіральних трубах тощо.Щоб полегшити клієнтам, ми також зварюємо труби.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.має найсучасніше обладнання для виробництва та тестування.Ми можемо повністю задовольнити ваші вимоги.Відповідно до дуже суворого стандарту, вироблені нами труби завжди мають правильний допуск OD і WT.Контроль толерантності суворо відповідає стандартам виробництва.Нашою продукцією завжди задоволені клієнти.Клієнти, які придбали наші продукти, отримали більше прибутку.
a) OD (зовнішній діаметр): від 3,18 мм до 101,6 мм
b) WT (товщина стінки): від 0,5 мм до 20 мм
c) Довжина: відповідно до вимог замовника
d) Стандарти: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 тощо
e) Метод обробки: ERW, EFW тощо

Повзунки, що показують три статті на слайді.Використовуйте кнопки «Назад» і «Далі» для переходу між слайдами або кнопки керування слайдами в кінці для переходу між слайдами.
Клітини черепного нервового гребеня (CNCC) відшаровуються від ембріональних нервових складок і мігрують до глоткових дуг, які утворюють більшість структур середньої частини обличчя.Дисфункція CNCC відіграє важливу роль в етіології орофаціальної щілини, поширеної вродженої вади розвитку.Гетерозиготні мутації SPECC1L були виявлені у пацієнтів з атиповими та синдромальними ущелинами.Тут ми повідомляємо про посилене фарбування компонентів канонічного адгезивного з’єднання (AJ), β-катеніну та E-кадгерину в культивованих нокдаун-клітинах SPECC1L, а електронні мікрофотографії показують апікально-базальну дифузію AJ.Щоб зрозуміти роль SPECC1L у черепно-лицевому морфогенезі, ми створили мишачу модель із дефектом Specc1l.Гомозиготні мутанти є ембріонально летальними та демонструють порушення закриття нервової трубки та ламінування CNCC.Фарбування білка AJ посилюється в мутантних нервових складках.Цей дефект AJ узгоджується з дефектом розшарування CNCC, що вимагає розчинення AJ.Крім того, мутанти Specc11 мають знижену передачу сигналів PI3K-AKT і посилений апоптоз.In vitro помірне інгібування передачі сигналу PI3K-AKT у клітинах дикого типу було достатнім для індукування змін AJ.Важливо, що зміни AJ, викликані нокдауном SPECC1L, можна скасувати шляхом активації шляху PI3K-AKT.У сукупності ці дані свідчать про те, що SPECC1L, як новий регулятор сигналізації PI3K-AKT і біології AJ, необхідний для закриття нервової трубки та стратифікації CNCC.
Клітини черепного нервового гребеня (CNCC) локалізуються в дорсальній нейроектодермі та відокремлюються від нейроепітелію нервових складок, що розвиваються, через процес, що включає епітеліально-мезенхімальний перехід (EMT)1,2,3.Премігруючі епітеліальні CNCC порушують міжклітинні з’єднання та стають мігруючими мезенхімальними CNCC, які заповнюють першу та другу глоткові дуги та утворюють більшу частину черепно-лицевого хряща.Таким чином, гени, які регулюють функцію CNCC, часто порушуються в етіології черепно-лицьових вроджених аномалій, таких як орофаціальні розщілини, які найчастіше вражають 1/800 пологів тільки в США.Одна з вроджених деформацій8.
Деламінація CNCC збігається із закриттям передньої нервової трубки між 8,5 і 9,5 днями ембріонального розвитку у мишей.Мутанти ряду генів, асоційованих із орофаціальною щілиною миші, також демонструють певну форму дефекту нервової трубки, включаючи Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 і Pdgfrα12.Однак процеси закриття нервової трубки та стратифікацію CNCC можна вважати незалежними, оскільки миша-мутант Splotch (Pax3) демонструє дефекти в закритті нервової трубки без жодного впливу на стратифікацію або міграцію CNCC 13,14.Додаткові мишачі моделі з дефектами розсічення CNCC і закриття нервової трубки допоможуть окреслити спільну молекулярну основу цих двох процесів.
Виділення CNCC з нейроепітеліальних клітин вимагає розчинення адгезивних з’єднань (AJ), які складаються з білкових комплексів, що містять, серед іншого, E-кадгерин, β-катенін, α-E-катенін і α-актинін, пов’язані з актиновими філаментами 2. Дослідження надекспресії E-кадгерину в нервових складках показали зменшення або затримку розшарування CNCC.І навпаки, пригнічення Е-кадгерину призводить до раннього розшарування15,16.Багато факторів, які опосередковують EMT під час стратифікації CNCC, є факторами транскрипції (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) і білками ремоделювання позаклітинного матриксу (ECM), такими як матричні металопротеїнази (MMP), однак CNCC є прямими цитоскелетними регуляторами AJ. ще не відомо.Відомо, що шлях PI3K-AKT антагонізує рівні E-кадгерину, в основному з досліджень раку17.Недавні дослідження показали, що втрата сигналізації PI3K-AKT на основі PDGFα у мишей призводить до черепно-лицьових аномалій, включаючи вовче піднебіння та дефекти нервової трубки12.Однак зв’язок між шляхом PI3K-AKT і стабільністю AJ при стратифікації CNCC неясний.
Раніше ми визначили SPECC1L як перший мутантний ген у двох людей із серйозною щілиною, яка поширюється від рота до ока, відомою як коса щілина (ObFC) або щілина Тессье IV18.Мутації SPECC1L були ідентифіковані у двох сім’ях із кількома поколіннями з аутосомно-домінантним синдромом Опіца G/ВВВ (OMIM № 145410), у яких хворі особи демонстрували гіпердистанцію та вовчу губу/піднебіння19, а також в одній родині з синдромом надмірної дистанції Тібі (OMIM № 145420)20 .більше половини випадків синдрому Опіца G/BBB є Х-зчепленими (OMIM #300000) і спричинені мутаціями в гені MID1, який кодує білок 22 асоційованого з мікротрубочками клітинного скелета.Ми припускаємо, що SPECC1L, також білок, асоційований з мікротрубочками та цитоскелетом актину, може опосередковувати передачу сигналів, необхідну для ремоделювання цитоскелету актину під час клітинної адгезії та міграції 18 .Завдяки дослідженням in vitro та in vivo ми тепер описуємо SPECC1L як новий регулятор стабільності AJ через передачу сигналів PI3K-AKT.На клітинному рівні дефіцит SPECC1L призводив до зниження рівня білка пан-АКТ і збільшення апікально-базальної дисперсії AJ, що було усунено шляхом хімічної активації шляху АКТ.In vivo ембріони з дефіцитом Specc11 демонструють порушення закриття нервової трубки та зменшене розсічення CNCC.Таким чином, SPECC1L функціонує у високорегульованій сигналізації на основі клітинної адгезії, необхідної для нормальної функції CNCC під час морфогенезу обличчя.
Щоб охарактеризувати роль SPECC1L на клітинному рівні, ми використали описану раніше стабільну лінію клітин остеосаркоми U2OS з дефіцитом SPECC1L18.Ці стабільні клітини U2OS з нокдауном SPECC1L (kd) мали помірне (60–70%) зниження рівнів транскриптів і білків SPECC1L, а також дефекти міграції та реорганізації актинового цитоскелету 18. Навпаки, різке тимчасове зниження рівня Показано, що SPECC1L призводить до мітотичних дефектів 23 .Після подальшої характеристики ми виявили, що наші стабільні клітини SPECC1L-kd змінили морфологію при дуже високому ступені злиття (рис. 1).Окремі контрольні клітини та клітини kd при низькому злитті виглядали подібно (рис. 1A, D).Через 24 години після злиття контрольні клітини зберегли свою кубоподібну форму (рис. 1B, E), тоді як клітини SPECC1L-kd витягнулися (рис. 1C, F).Ступінь цієї зміни форми клітини було зафіксовано за допомогою візуалізації in vivo контрольних клітин і клітин kd (фільм 1).Щоб визначити роль SPECC1L у конфлюентних клітинах, ми спочатку дослідили його експресію.Ми виявили, що рівні білка SPECC1L зросли після злиття (Малюнок 1G), тоді як рівні транскриптів SPECC1L не підвищилися (Малюнок 1H).Крім того, зі збільшенням щільності клітин білок SPECC1L накопичувався на міжклітинних кордонах (рис. 2A-E), причому картина перекривалася з мембранно-асоційованим β-катеніном (рис. 2A'-E').Враховуючи зв’язок SPECC1L з актиновим цитоскелетом 18,23, ми припустили, що SPECC1L взаємодіє з адгезивними з’єднаннями на основі актину (AJ).
(AF) Нокдаун-клітини SPECC1L (DF) подовжуються при високому злитті (F) порівняно з контрольними клітинами U2OS (AC).Тут показано три з шести часових точок (T1, T3, T6), які ми вибрали для різних щільностей клітин.(G) Вестерн-блот аналіз, який показує, що білок SPECC1L стабілізується при високому ступені злиття порівняно з низьким ступенем злиття в контрольних клітинах.Вестерн-блот SPECC1L показує очікувану смугу 120 кДа та смугу вищої молекулярної маси, можливо, модифіковану після трансляції (*).Вестерн-блот аналіз проводили за однакових умов для низького та високого злиття.Зображення, що показують SPECC1L при низькому та високому злитті, були взяті з того самого блоту.Той самий блот був видалений і повторно досліджений антитілом до β-актину.(H) Кількісний аналіз RT-PCR не показав значних змін у рівнях транскриптів SPECC1L.Смуги похибок представляють SEM з чотирьох незалежних експериментів.
(AE) Ми вибрали шість часових точок (T1-T6), що представляють діапазон щільності клітин, щоб нормалізувати аналіз форми клітин і зміни AJ у клітинах U2OS з нокдауном SPECC1L (kd).Перші п’ять із цих часових точок включали поодинокі клітини (T1), 50-70% злиття малих клітинних кластерів (T2), злиття без зміни форми клітин kd (T3), зміну форми клітин kd (T4) і 24-годинні зміни.у задній формі клітин kd (T5).Білок SPECC1L був переважно диспергований у цитоплазмі на T1 (A), але його накопичення спостерігалося на міжклітинних кордонах у наступні моменти часу (B–E, стрілки).(FJ) β-катенін демонструє подібне накопичення на міжклітинних кордонах, пов’язаних з комплексом AJ.(A'-E') SPECC1L і β-катенін показують перекриття фарбування на кордонах клітин при високій щільності клітин (стрілки).(F'-J') У клітинах SPECC1L-kd фарбування β-катеніну виглядає нормальним при низькій щільності клітин (F'-H'), але розширюється зі зміною форми клітин (I', J'; стрілки), що вказує на те, що AJ змінилися.Бруски = 10 мкм.
Потім ми спробували визначити вплив дефіциту SPECC1L на AJ.Ми використовували кілька AJ-асоційованих маркерів, включаючи канонічні компоненти F-актин, міозин IIb, β-катенін і E-кадгерин24,25,26,27.Актинові стресові волокна зросли в клітинах SPECC1L-kd, як описано раніше (рис. 3A, B) 18 .Міозин IIb, асоційований з філаментами актину, продемонстрував подібне збільшення клітин SPECC1L-kd in vitro (рис. 3C, D).AJ-асоційований β-катенін зв’язується з кадгерином на клітинній мембрані, демонструючи нормальний «стільниковий» патерн експресії в контрольних кубоцитах (рис. 3E, G).Цікаво, що на плоских зображеннях, отриманих за допомогою конфокальної мікроскопії, фарбування β-катеніном (рис. 3E, F) і E-кадгерину (рис. 3G, H) на клітинній мембрані конфлюентних SPECC1L-дефіцитних клітин показало помітні моделі розширеного фарбування.Це розширення пов’язаного з AJ фарбування β-катеніну в клітинах kd було найбільш вираженим при злитті, але, здається, передувало змінам у формі клітини (рис. 2F-J, F'-J').Щоб визначити фізичну природу цього розширеного фарбування AJ, ми дослідили межі клітин на апікально-базальній поверхні клітин SPECC1L-kd U2OS за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії (ТЕМ) (Рис. 3I,J).На відміну від контрольних клітин (рис. 3I), які мали окремі ділянки електронної щільності, що вказують на AJ (стрілки), клітини kd (рис. 3J) показали великі, суміжні області високої електронної щільності, що вказує на AJ уздовж апікобазальної площини..Крім того, на поперечних зрізах ми спостерігали великі складки клітинної мембрани в клітинах kd (рис. S1A, B), що пояснює розширену картину смуг фарбування β-катеніну та E-кадгерину (рис. 3F, H).На підтвердження ролі SPECC1L у AJs, β-катенін був імунопреципітований разом із SPECC1L у лізатах конфлюентних клітин U2OS (рис. 3K).Разом із розширеним імунним фарбуванням для маркерів AJ аналіз TEM узгоджувався з нашою гіпотезою про те, що дефіцит SPECC1L збільшує апікально-базальну щільність і дисперсію AJ.
(AH) Підвищене фарбування F-актину в клітинах kd через 48 годин після злиття (T6; A, B).Змінене фарбування міозину IIb, пов'язаного з F-актином (C, D).Плавний малюнок фарбування мембрани β-катеніну та Е-кадгерину в контрольних клітинах (E, G) був посилений у клітинах SPECC1L-kd (F, H).Бруски = 10 мкм.(I–J) Електронні мікрофотографії, що спостерігають апікально-базальне міжклітинне з’єднання.Контрольні клітини демонструють чіткі ділянки електронної щільності, що вказують на липкі з’єднання (I, стрілки).Навпаки, весь апікально-базальний з’єднання в клітинах SPECC1L-kd виглядав електронно-щільним (J, стрілки), що вказує на підвищену щільність і дисперсію адгезивних з’єднань.(K) β-катенін був ко-імунопреципітований з SPECC1L у конфлюентних лізатах клітин U2OS.Зображення, зроблене з однієї точки, представляє один із чотирьох незалежних експериментів.
Щоб зрозуміти роль SPECC1L у черепно-лицевому морфогенезі, ми створили мишачу модель із дефектом Specc1l, використовуючи дві незалежні клітинні лінії пастки ES, DTM096 і RRH048 (BayGenomics, Каліфорнія), які представляють інтрон 1, а транскрипти Specc1l були захоплені на 15 (рис. 1) .4A, малюнок S2).Геномне розташування вставки вектора-приманки було визначено шляхом секвенування повного геному та підтверджено ПЛР (рис. S2).Обидва дизайни генних пасток також дозволяли злиття репортерів Specc11-lacZ у кадрі після захоплення.Тому експресію lacZ, визначену фарбуванням X-gal, використовували як індикатор експресії Specc11.Обидва алелі продемонстрували подібні моделі експресії lacZ, причому пастка гена DTM096 в інтроні 1 демонструвала сильнішу експресію, ніж RRH048 в інтроні 15 (не показано).Однак Specc1l широко виражений, з особливо сильною експресією в нервових складках на E8.5 (рис. 4B), у нервовій трубці та лицьових відростках на E9.5 і E10.5 (рис. 4C, D), а також у кінцівках, що розвиваються. на E10.5 і очі (Малюнок 4D).Раніше ми повідомляли, що експресія SPECC1L у першій глотковій дузі на E10.5 була присутня в епітелії та підлеглій мезенхімі18, що відповідає лінії CNCC.Щоб перевірити експресію SPECC1L в CNCC, ми виконали нейронні складки E8.5 (Рис. 4E-J) і E9.5 зрізи черепа (Рис. 4K-).На E8.5 SPECC1L інтенсивно забарвлює нервові складки (рис. 4E, H), включаючи клітини, пофарбовані маркерами NCC (рис. 4G, J).На E9.5 SPECC1L (рис. 4K, N) сильно забарвлює мігруючий CNCC, пофарбований одночасно з AP2A (рис. 4L, M) або SOX10 (рис. 4O, P).
(A) Схематичне зображення гена Specc11 миші, що демонструє вставку вектора-приманки в клітинні клони ES DTM096 (інтрон 1) і RRH048 (інтрон 15).(BD) Фарбування lacZ гетерозиготних ембріонів Specc1lDTM096, що представляє експресію Specc1l від E8.5 до E10.5.NE = нейроектодерма, NF = нервова складка, PA1 = перша глоткова дуга.(EP) Імунне фарбування SPECC1L з маркерами NCC AP2A та SOX10 у E8.5 (NF; EJ) нервових складках та E9.5 (KP) зрізах черепа.Фарбування SPECC1L широко спостерігалося в нервових складках E8.5 (E, H; стрілки), включаючи клітини, помічені AP2A (F, G; стрілки) і SOX10 (I, J; стрілки).На E9.5 SPECC1L сильно пофарбував мігруючі CNCC (K, N; стрілки), помічені AP2A (L, M; стрілки) та SOX10 (O, P; стрілки).
Схрещування гетерозиготних мишей Specc1lDTM096/+ і Specc1lRRH048/+ показує, що два алелі генної пастки не є комплементарними і що складні гетерозиготи та ембріональні гомозиготи для будь-якого алеля генної пастки є ембріонально летальними (таблиця S1).Менделівські коефіцієнти вказують на зниження рівня виживання гетерозигот при народженні (очікуваний 1,34 проти 2,0).Ми відзначили низьку перинатальну смертність серед гетерозигот, деякі мали черепно-лицеві аномалії (рис. S3).Однак низька пенетрантність цих перинатальних краніофаціальних фенотипів ускладнює вивчення їхніх основних патофізіологічних механізмів.Тому ми зосередилися на ембріональному летальному фенотипі гомозиготних мутантів Specc11.
Більшість складних гетерозиготних або гомозиготних мутантних ембріонів Specc1lDTM096/RRH048 не розвивалися після E9.5–10.5 (рис. 5A–D), і нервова трубка не закривалася спереду (рис. 5B, D), а іноді закривалася ззаду (не показано) ..Цей дефект закриття черепної нервової трубки був пов’язаний із тим, що більшість DLX2, позначених CNCC, залишалися в нервових складках на E10.5, що вказувало на відсутність дисекції (Рис. 5A'-D').Щоб визначити, чи загальний розмір CNCC також зменшився, ми позначили лінії CNCC за допомогою GFP у наших лініях генних пасток за допомогою Wnt1-Cre та ROSAmTmG.Ми транслюємо відсортовані GFP+ NCC і GFP- (RFP+) не-NCC з цілих ембріонів.На етапі E9.5 частка відсортованих GFP-мічених CNCC істотно не змінилася між WT і мутантними ембріонами (не показано), що вказує на нормальну специфікацію CNCC.Таким чином, ми припустили, що залишкове фарбування Wnt1-Cre і DLX2 у відкритих нервових складках (рис. 5B') було спричинене дефектним шаруванням CNCC, можливо, через підвищену щільність або дисперсію клітин AJ, як це видно в клітинах SPECC1L-kd.Ми використовували маркери NCC SOX10, AP2A та DLX2, щоб підтвердити наявність CNCC у нервовій складці (рис. 5E-R).На E8.5 фарбування нервової складки для всіх трьох маркерів NCC спостерігалося в зрізах WT (рис. 5E, G, I) і мутанта Specc1l (рис. 5F, H, J).На E9.5, у той час як маркери NCC забарвлювали мігруючий NCC у зрізах WT (рис. 5M, O, Q), залишкове фарбування NCC спостерігалося в експонованих нервових складках мутантних ембріонів Specc1l (рис. 5N, P, R).Оскільки SOX10 і DLX2 позначають мігруючі CNCC, цей результат свідчить про те, що SPECC1L-дефіцитні CNCC досягають постміграційної специфікації, але не можуть мігрувати з нервових складок.
Дефіцит Specc11 призводить до дефектного закриття нервової трубки, відшарування клітин черепного нервового гребеня та AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Ембріон, що несе мігруючі клітини черепного нервового гребеня (CNCC), помічені Wnt1-Cre (A').Навпаки, мутантні ембріони Specc11 демонструють відкриті нервові складки (B), наконечники стрілок) і CNCC, які не мігрували (B', наконечники стрілок).(C, D') Зображення в яскравому полі (C, D') та імунне фарбування (C', D') маркера CNCC DLX2 ембріонів E10.5 WT (C, C') і Specc1l (D, D').У ембріонів WT E10.5 DLX2-позитивний CNCC колонізує зяброві дуги (C', стрілки), тоді як у мутантів помітне фарбування зберігається у відкритих нервових складках (D', стрілки) і в перших дугах глотки (D', стрілки).) з деяким фарбуванням (стрілки), що вказує на погане розшарування та міграцію CNCC.ER) Зрізи мутантних ембріонів WT та Specc1l на стадіях E8.5 (E–L) та E9.5 (M–R) були помічені маркерами NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) і DLX2 (I, J, Q, R).На E8.5 фарбування NCC спостерігалося в нервовій складці дикого типу (NF) і мутантних зрізах.Спільне фарбування SOX10 і β-катеніну в E8.5 WT (K) і мутанта (L) виявило підвищене фарбування β-катеніну на кордонах клітин у нервових складках.На E9.5 спостерігалося фарбування мігруючих CNCC дикого типу (M, O, Q), тоді як у мутантів нестратифіковані CNCC забарвлювали відкриті нервові складки (N, P, R).(S–Z) Аналіз маркування AJ in vivo в корональних зрізах ембріонів WT і Specc11DTM096/RRH048 з мутацією E9.5.У правому верхньому куті показана приблизна площина перерізу.У зрізах мутантних тканин спостерігали підвищене забарвлення F-актину (S, T) і міозину IIb (U, V).Подібно до результатів in vitro на рис. 3, у мутантних ембріонів спостерігалося посилене фарбування мембрани для β-катеніну (W, X) та E-кадгерину (Y, Z).(AA-BB) Електронна мікрофотографія ділянки ембріона дикого типу, яка виглядає за межею апікально-базальної клітини, показує чітку область електронної щільності, що вказує на адгезивні з’єднання (AA, стрілки).Навпаки, у зрізах мутантних ембріонів Specc11 (BB, стрілки) весь апікобазальний з’єднання є електронним щільним, що вказує на підвищену щільність і дисперсію адгезивних з’єднань.
Щоб перевірити нашу гіпотезу про те, що зменшення нашарування пов’язане зі зміненим AJ, ми дослідили маркування AJ у відкритих нервових складках мутантних ембріонів Specc1l (рис. 5S-Z).Ми спостерігали збільшення актинових стресових волокон (рис. 5S, T) і супутню посилену локалізацію фарбування міозину IIB на актинових волокнах (рис. 5U, V).Важливо, що ми спостерігали посилення фарбування β-катеніну (рис. 5W, X) і E-кадгерину (рис. 5Y, Z) на міжклітинних кордонах.Ми також перевірили фарбування β-катеніном NCC у нервових складках ембріонів E8.5 (рис. 5K, L).Фарбування β-катеніном виявилося сильнішим у мутантних нейронних складках Specc1l (рис. 5L і K), що свідчить про те, що почалися зміни AJ.На електронних мікрофотографіях зрізів черепа ембріонів E9.5 ми знову спостерігали посилене дифузне фарбування електронною щільністю в мутантних ембріонах Specc1l порівняно з WT (рис. 5AA, BB і S1E-H).У сукупності ці результати підтверджують наші результати in vitro для клітин SPECC1L-kd U2OS і припускають, що аномальне фарбування AJ передує стратифікації CNCC у наших мутантних ембріонів.
Враховуючи відомий антагоністичний зв’язок між активністю AKT і стабільністю Е-кадгерину17,28, ми висунули гіпотезу про залучення сигналізації PI3K-AKT.Крім того, ми спостерігали субепідермальні пухирі у деяких наших мутантних ембріонів, які уникли летальності (<5%) на E9,5-10,5 і замість цього осіли приблизно на E13,5 (рис. S3).Субепідермальні везикули є ознакою зниженої передачі сигналу PI3K-AKT на основі PDGFRα12.Fantauzzo та ін.(2014) повідомили, що порушення активації PI3K на основі PDGFRα в мутантних ембріонах PdgfraPI3K/PI3K призводить до субепідермальних везикул, дефектів нервової трубки та фенотипів вовчого піднебіння.Дійсно, рівні пан-АКТ і активного фосфорильованого Ser473-АКТ були знижені in vivo в мутантних тканинах Specc1l до арешту ембріона E9.5 (рис. 6A-D).Зниження рівнів фосфорильованого Ser473-AKT може бути повністю пов’язане зі зниженням рівнів пан-AKT in vivo (ФІГ. 6E) та in vitro (Фіг. 6F).Зменшення in vitro спостерігалося лише тоді, коли клітини U2OS сильно злилися зі змінами форми клітин і щільності AJ (рис. 6D).Таким чином, наші дані свідчать про те, що SPECC1L є новим позитивним регулятором сигналізації PI3K-AKT у черепно-лицевому морфогенезі.
(A–E) E8.5 (A, B) та E9.5 (C, D) зрізи черепа або E9.5 лізати з мутантних ембріонів Specc1l (E), що показують рівні активного фосфорильованого S473-AKT та зменшення пан-AKT протеїну , порівняно з контрольною WT.Вестерн-блоттинг проводили на лізатах дикого типу та мутантних лізатах за однакових умов.Зображення, показані для SPECC1L, були взяті з однієї плями.Той самий блот був видалений і повторно досліджений антитілами проти пан-ACT і β-актину.Рівні пан-AKT у нервових складках E8.5 (A, B) і рівні фосфорильованого S473-AKT у зрізах черепа E9.5 були значно знижені.(F) Рівні Pan-AKT були аналогічно знижені в лізатах клітин SPECC1L-kd U2OS, зібраних при високому злитті.Смуги похибок представляють SEM з трьох незалежних кількісних аналізів вестерн-блоту.(GJ) Зрізи ембріонів WT на E9.5, пофарбовані KI67 і розщепленою каспазою 3, відповідно, демонструють проліферацію клітин (G, G') і незначну апоптотичну активність (H, H').Мутантні ембріони Specc11 демонструють порівнянну клітинну проліферацію (I), але кількість клітин, які зазнають апоптозу, значно збільшується (J).
Потім ми досліджували маркери проліферації та апоптозу.Ми не спостерігали жодної різниці в проліферації ембріонів E9.5 (рис. 6E, G порівняно з I) з індексом проліферації 82,5% для мутантів WT і 86,5% для мутантів Specc1l, виміряним за допомогою фарбування KI67 (p <0,56, Фішера). точний тест).Подібним чином ми не спостерігали жодної різниці в апоптозі, виміряному за допомогою фарбування на розщеплену каспазу 3 у нервових складках на E8.5 до зупинки ембріона (не показано) (не показано).Навпаки, апоптоз був значно посилений у всіх мутантних ембріонах E9.5 (рис. 6F, H і J).Це загальне збільшення апоптозу узгоджується зі зниженою передачею сигналів PI3K-AKT і ранньою ембріональною летальністю29,30,31.
Далі, щоб підтвердити причинну роль сигналізації PI3K-AKT у змінах AJ у наших клітинах kd, ми хімічно змінили шлях у контрольних і kd-клітинах (рис. 7A-F).Ми використовували як маркер фенотип зміни форми клітини, який спостерігався в конфлюентних клітинах SPECC1L-kd, який ми кількісно визначили за допомогою співвідношення найдовшого розміру (довжини) до відповідного вертикального розміру (ширини).Очікується співвідношення 1 для відносно круглих або кубоподібних комірок (рис. 7G).Окрім форми клітини, ми також підтвердили вплив на AJ за допомогою фарбування β-катеніну (рис. 7A'-F').Інгібування шляху PI3K-AKT за допомогою вортманніну було достатнім для зміни форми клітин у контрольних клітинах (рис. 7A, C) і AJ (рис. 7A').Активатор PI3K-AKT SC-79 не впливав на форму клітини (Фіг. 7A, E) або розширення AJ (Фіг. 7A') у контрольних клітинах.У клітинах SPECC1L-kd подальше пригнічення шляху PI3K-AKT призвело до посилення апоптозу (рис. 7B, D) і помітного збільшення фарбування β-катеніну (рис. 7B'), що відповідає нашим важким мутантам in vivo.Важливо, що активація шляху PI3K-AKT значно покращила форму клітини (Рис. 7B, F) і фенотипи AJ (Рис. 7B”).Зміни у формі клітин кількісно оцінювали як коефіцієнт округлості клітин (CCR) і порівнювали на значущість, як описано вище (ФІГ. 7G).Дійсно, у контрольних клітинах (рис. 7G, CCR = 1,56) лікування вортманніном було достатнім для значної зміни форми клітини (рис. 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) до ступеня, подібного до спостережуваного в SPECC1L.-kd клітин (рис. 7G, CCR = 3,46).Обробка клітин SPECC1L-kd вортманніном (рис. 7G, CCR = 3,60, незначний) не була більш значущою, ніж необроблені клітини kd (рис. 7G, CCR = 3,46, незначний) або оброблені вортманніном контрольні клітини (рис. 7G)., CCR = 3,46, незначний) додатково впливає на подовження клітини (7G, CCR = 3,61, незначний).Найголовніше, що активатор SC-79 AKT відновив подовжений фенотип клітин SPECC1L-kd (рис. 7G, CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Ці результати підтверджують, що SPECC1L регулює передачу сигналів PI3K-AKT, і припускають, що помірне зниження SPECC1L впливає на адгезію клітин, тоді як сильне зниження призводить до апоптозу (рис. 8).
(A–F') Контрольні (A, C, E) і SPECC1L-kd (B, D, F) клітини, оброблені інгібітором шляху PI3K-AKT вортманніном (C, D) або активатором SC-79 (E, F) Лікування .Необроблені контрольні клітини мають форму куба (A) з нормальним клітинним фарбуванням β-cat (A'), тоді як клітини kd витягнуті (B) з підвищеним фарбуванням β-cat (B').Після придушення шляху PI3K-AKT контрольні клітини витягнулися (C) із розширенням β-cat (C'), тоді як клітини kd почали піддаватися апоптозу (D), подібно до наших сильно мутованих ембріонів і демонструючи надзвичайно посилений β-cat.фарбування (D').Після активації шляху PI3K-AKT контрольні клітини залишалися кубоподібними (E) і мали нормальне фарбування β-cat (E'), тоді як клітини kd показали значно покращену форму клітин (F) і фарбування β-cat (F'), що вказує на (G) Ступінь зміни форми клітини в (AF) кількісно визначали за допомогою коефіцієнта округлості клітини (CCR) найдовшого розміру (довжини) та відповідного вертикального розміру (ширини) за допомогою програмного забезпечення MetaMorph.Необроблені (NT) клітини SPECC1L-kd (CCR = 3,46) були значно довшими, ніж контрольні клітини (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10–13).Інгібування Вортом шляху PI3K-AKT у контрольних клітинах було достатнім, щоб викликати подібне подовження форми клітин (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Подібним чином, активація AKT за допомогою SC-79 у клітинах SPECC1L-kd відновила подовження клітин до контрольних рівнів (CCR = 1,74, p <6,2 × 10–12).Обробка клітин SPECC1L-kd вортманніном призвела до посилення апоптозу, але не до подальшого збільшення зміни форми клітин (CCR=3,60) порівняно з необробленими kd (CCR=3,46, ns) або контрольними клітинами, обробленими вортманніном (3,61), що спостерігалося в .ns = не має значення.Показано вимірювання +/- SEM для 50 клітин.Статистичні відмінності розраховували за допомогою t-критерію Стьюдента.
(A) Схематичне зображення інгібування та активації шляху PI3K-AKT, що призводить до змін AJ та відновлення відповідно.(B) Запропонована модель для стабілізації білка AKT за допомогою SPECC1L.
Преміграційні CNCC потребують лізису AJ для відділення від нейроепітеліальних клітин передньої нервової складки1,15,32.Посилене фарбування компонентів AJ та втрата асиметричного розподілу апікально-базального AJ у SPECC1L-дефіцитних клітинах як in vitro, так і in vivo, у поєднанні з фізичною близькістю SPECC1L до β-катеніну, припускають, що SPECC1L функціонує для належної підтримки локальної стабільності AJ для організаційні м'язи.актиновий цитоскелет.Асоціація SPECC1L з актиновим цитоскелетом і β-катеніном і збільшення кількості конденсованих актинових ниток за відсутності SPECC1L узгоджується зі спостережуваним збільшенням щільності AJ.Інша можливість полягає в тому, що збільшення кількості актинових волокон у SPECC1L-дефіцитних клітинах призводить до зміни міжклітинної напруги.Оскільки клітинний стрес впливає на динаміку AJ 33, зміни напруги можуть призвести до більш дифузного AJ 34 .Тому будь-які зміни вплинуть на шари CNCC.
Wnt1 експресується в ранніх нервових складках, які дають початок клітинам нервового гребеня.Таким чином, трасування походження Wnt1-cre позначає як до, так і міграційний NCC35.Однак Wnt1 також позначає клони дорсальної тканини мозку, також отримані з ранніх нейронних складок 35,36, що робить ймовірним те, що наше фарбування мутантів E9.5 для маркерів Wnt1 у відкритих нервових складках не є CNCC.Наше позитивне фарбування на маркери NCC AP2A та SOX10 підтвердило, що відкриті нервові складки мутантних ембріонів Specc11 справді містили CNCC.Крім того, оскільки AP2A та SOX10 є маркерами ранньої міграції NCC, позитивне фарбування вказує на те, що ці клітини є постміграційними CNCC, які не можуть бути стратифіковані за E9.5.
Наші дані свідчать про те, що молекулярна регуляція AJ за допомогою SPECC1L опосередковується передачею сигналів PI3K-AKT.Передача сигналів AKT знижена в клітинах і тканинах з дефіцитом SPECC1L.Висновки Fantauzzo та ін.підтверджують пряму роль сигналізації PI3K-AKT у черепно-лицьовому морфогенезі.(2014) показали, що відсутність активації передачі сигналів PI3K-AKT на основі PDGFRα призводить до фенотипу вовчого піднебіння.Ми також показуємо, що інгібування шляху PI3K-AKT достатньо для зміни форми AJ і клітини в клітинах U2OS.Згідно з нашими висновками, Cain et al.37 показали, що зниження регуляції субодиниці PI3K α110 в ендотеліальних клітинах призводить до подібного збільшення фарбування перицелюлярного β-катеніну, що називається збільшенням «індексу зв’язності».Однак в ендотеліальних клітинах, чиї нитки актину вже високоорганізовані, пригнічення шляху PI3K-AKT призводить до пухкої форми клітин.Навпаки, клітини SPECC1L-kd U2OS показали витягнуту форму клітини.Ця відмінність може бути специфічною для типу клітини.У той час як пригнічення передачі сигналу PI3K-AKT постійно впливає на актиновий цитоскелет, вплив на форму клітини визначається змінами напруги, спричиненими змінами щільності та організації центральних актинових волокон.У клітинах U2OS ми використовували лише зміни форми клітин як маркер зміни та відновлення AJ з дефіцитом SPECC1L.На закінчення ми припускаємо, що інгібування шляху AKT при дефіциті SPECC1L підвищує стабільність AJ і зменшує розшарування в CNCC.
Цікаво, що рівні пан-AKT були знижені in vitro та in vivo на додаток до фосфорильованих рівнів 473-AKT за відсутності SPECC1L, що свідчить про регуляцію сигналізації PI3K-AKT на рівні стабільності або обороту білка AKT.Гени SPECC1L і MID1, обидва асоційовані з синдромом Opitz/GBBB, кодують білки, які стабілізують мікротрубочки 18,22.Механізм, за допомогою якого SPECC1L і MID1 забезпечують стабілізацію мікротрубочок, до кінця не вивчений.У випадку SPECC1L ця стабілізація включає посилене ацетилювання підгрупи мікротрубочок 18 .Цілком можливо, що SPECC1L використовує подібний механізм для стабілізації інших білків, таких як AKT.Було показано, що ацетилювання залишків лізину в білку AKT призводить до зниження локалізації мембрани та фосфорилювання38.Крім того, убіквітування ланцюга K63 за тим самим залишком лізину на AKT необхідне для його мембранної локалізації та активації39,40.Серед кількох факторів, які взаємодіють з білками SPECC1L, ідентифікованими в різних високопродуктивних дріжджових двогібридних скринінгах, чотири – CCDC841, ECM2942, APC і UBE2I43 – були причетні до обороту або стабільності білка через убіквітування або сумоїлювання.SPECC1L може брати участь у посттрансляційній модифікації залишків лізину AKT, що впливає на стабільність AKT.Однак критичну роль SPECC1L у локалізації та стабільності білка AKT ще належить з’ясувати.
Серйозні дефекти експресії SPECC1L in vivo призвели до посилення фарбування маркера AJ і дефектного накладення CNCC, а також посилення апоптозу та ранньої ембріональної летальності.Попередні звіти показали, що мишачі мутанти з підвищеним рівнем апоптозу пов’язані з дефектами нервової трубки 44, 45, 46, 47 та краніофаціальними дефектами 48.Було припущено, що надмірна смерть клітин у нервових складках або дугах глотки може призвести до недостатньої кількості клітин, необхідних для належного морфогенетичного руху 48,49,50.Навпаки, наші клітинні лінії з дефіцитом SPECC1L із помірно зниженою експресією SPECC1L показали лише зміни AJ без ознак посилення загибелі клітин.Однак хімічне інгібування шляху PI3K-AKT у цих клітинах Kd призвело до збільшення апоптозу.Таким чином, помірне зниження експресії або функції SPECC1L забезпечує виживання клітини.Це узгоджується зі спостереженням, що рідкісні мутантні ембріони Specc11, які уникли арешту на ст.E9.5 — можливо, через знижену ефективність захоплення генів — здатні закривати свої нервові трубки та зупинятися на більш пізньому етапі розвитку, часто з краніофаціальними дефектами (рис. S3).Також це узгоджується з рідкісним випадком гетерозиготних ембріонів Specc1l із черепно-лицьовими аномаліями — ймовірно, через підвищену ефективність захоплення генів — а також знахідкою у рибок даніо, у яких один із двох ортологів SPECC1L (specc1lb) викликає пізні ембріональні фенотипи, включаючи втрату нижні щелепи та двосторонні розщілини51.Таким чином, гетерозиготні мутації втрати функції SPECC1L, виявлені у пацієнтів-людей, можуть спричиняти невеликі порушення функції SPECC1L під час черепно-лицевого морфогенезу, достатні для пояснення їхніх орофаціальних щілин.Регулювання міжклітинних контактів на основі SPECC1L також може відігравати роль у палатогенезі та злитті глоткових дуг.Подальші дослідження функції SPECC1L допоможуть з’ясувати роль тимчасових міжклітинних контактів у CNCC під час закриття нервової трубки в рухливості нейроепітеліальних клітин і краніофаціальному морфогенезі.
Контроль остеосаркоми U2OS і клітини SPECC1L-kd були описані раніше (Saadi et al., 2011).Антитіла проти SPECC1L також були охарактеризовані раніше (Saadi et al., 2011).Антитіла до β-катеніну (кролик; 1:1000; Санта-Крус, Даллас, Техас) (миша; 1:1000; Cell Signaling Technology, Денверс, Массачусетс), міозин IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, Сент-Луїс ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Каліфорнія), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), розщеплена каспаза 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) і β-актин (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) використовували, як описано..Актинові нитки фарбували Acti-stain rodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Контрольні клітини U2OS і клітини SPECC1L-kd культивували в стандартній DMEM з високим вмістом глюкози з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки (Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія).Для змін AJ 2 x 105 клітин висівали на скло, оброблене 0,1% свинячим желатином (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) і спостерігали за змінами у формі клітин.Клітини збирали в різні вказані моменти часу: через 4 години після посіву (t = 1), через 24 години після посіву (t = 2), злиття без зміни форми клітини (t = 3), зміни форми клітини (t = 4) , через 24 год після зміни форми клітини (t = 5) та через 48 год після зміни форми клітини (t = 6) (рис. 1, 2, 3).Щоб модулювати шлях PI3K-AKT, клітини культивували у зазначених концентраціях з інгібітором PI3K-AKT вортманніном (TOCRIS Biosciences, Міннеаполіс, Міннесота) або активатором SC-79 (TOCRIS Biosciences, Міннеаполіс Адамс, Міннесота).Середовище, що містить хімічні речовини, змінювали щодня.
Покадровий запис робили на живих контрольних клітинах і клітинах KD у нормальних умовах культивування, а фазово-контрастні зображення збирали кожні 10 хвилин протягом 7 днів.Зображення отримували за допомогою інвертованого мікроскопа Leica DM IRB з комп’ютерним керуванням, оснащеного механічним столиком і об’єктивом 10 × N-PLAN, підключеним до камери QImaging Retiga-SRV.Під час візуалізації культури клітин підтримували при 37°C у вологій атмосфері з 5% CO2.
Дві клітинні лінії генної пастки ES DTM096 і RRH048 з Регіонального ресурсного центру мутантних мишей (Каліфорнійський університет у Девісі, Каліфорнія) були використані для створення ліній мишей з дефіцитом Specc11, позначених Specc1lgtDTM096 і Specc1lgtRRH046.Коротко, клітини 129/REJ ES вводили в бластоцисти C57BL6.Отриманих химерних мишей-самців скрестили з мишами-самками C57BL6 для ідентифікації потомства із забарвленням шерсті агуті.Для ідентифікації гетерозигот використовували наявність векторних вставок генної пастки.Мишей утримували на змішаному фоні 129/REJ; C57BL6.Розташування сайту вставки вектора генетичної пастки було підтверджено за допомогою RT-PCR, секвенування генома та генетичної комплементації (додатковий малюнок 1).Щоб простежити лінію CNCC подвійних гетерозиготних мишей Specc1lGT, мишей ROSAmTmG (#007576) і Wnt1-Cre (#003829) (Джексонова лабораторія, Бар-Харбор, ME) схрестили для отримання алелей ROSAmTmG і Wnt1-Cre в мутантних ембріонах Specc1l.Усі експерименти на мишах проводили відповідно до протоколів, затверджених Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Медичного центру Університету Канзасу.
Ембріони фіксували в (1% формальдегід, 0,2% глутаровий альдегід, 2 мМ MgCl2, 0,02% NP-40, 5 мМ EGTA) протягом 60 хвилин при кімнатній температурі.Після фіксації в розчині для фарбування X-gal (5 мМ фериціаніду калію, 5 мМ фероціаніду калію, 2 мМ MgCl2, 0,01% дезоксихолату натрію, 0,02% NP-40, 1 мг/мл X-gal) фарбування проводили при 37°C .°C протягом 1-6 годин.Ембріони постфіксували в 4% PFA і візуалізували.
Для вестерн-блоттингу клітини лізували в буфері для пасивного лізису (Promega, Фітчбург, Вісконсин), доповненому сумішшю інгібіторів протеази HALT (Sigma-Aldrich, Сент-Луїс, Міссурі).Лізати обробляли на 12% поліакриламідних готових гелях Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, Hercules, CA) і переносили на мембрани Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Мембрани блокували в 5% молоці в PBS, що містить 0,1% Tween.Антитіла інкубували протягом ночі при 4°C або протягом однієї години при кімнатній температурі.Для генерації сигналу використовувався реагент Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA).Для імунного фарбування ембріони фіксували протягом ночі в 4% PFA/PBS і кріоконсервували.Кріозрізи тканини блокували в PBS, що містив 1% нормальної козячої сироватки (Thermo Scientific, Waltham, MA) і 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), а потім інкубували при 4°C в інкубаторі протягом ніч.з анти-антитілом і флуоресцентним вторинним антитілом (1:1000) протягом 1 години при 4°C.Пофарбовані зрізи поміщали в середовище ProLong gold (Thermo Scientific, Waltham MA) і плоскі зображення отримували за допомогою конфокального мікроскопа Leica TCS SPE.Кожне імунне фарбування проводили як три незалежні експерименти на циросекціях щонайменше двох мутантних ембріонів.Показано типовий експеримент.
Клітини інкубували в модифікованому буфері RIPA (20 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 мМ NaCl, 10% гліцерину, 2 мМ EDTA та інгібітор протеази HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Коротко, лізати попередньо очищали магнітними кульками протеїну G (Life Technologies, Карлсбад, Каліфорнія), а потім інкубували протягом ночі при 4°C з анти-SPECC1L або IgG Білкові кульки G білка використовували для екстракції SPECC1L і проводили вестерн-блоттинг із застосуванням анти-SPECC1L. Антитіло до -β-катеніну, описане вище. Показані експерименти спільного IP є репрезентативними для чотирьох незалежних експериментів.
Фіксовані культивовані клітини або ембріональні тканини миші були надані в центр електронної мікроскопії в медичному центрі Університету Канзасу.Коротко кажучи, зразки заливали в смолу EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Форт-Вашингтон, Пенсільванія), полімеризували протягом ночі при 60°C і розділяли при 80 нм за допомогою ультрамікротома Leica UC7, оснащеного алмазним лезом.Зрізи візуалізували за допомогою трансмісійного електронного мікроскопа JEOL JEM-1400, оснащеного гарматою Lab6 на 100 кВ.
Як цитувати цю статтю: Wilson, NR et al.Дефіцит SPECC1L призводить до підвищення стабільності зрощених суглобів і зменшення розшарування клітин черепного нервового гребеня.наука.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Сен-Жанн, Ж.-П.Індукція та диференціація нервового гребеня.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR та ін.Клітини черепно-мозкового гребеня в русі: їх роль у черепно-лицьовому розвитку.Американський журнал медичної генетики.Частина A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Боланд, Р. П. Нейрокрістопатія: її ріст і розвиток протягом 20 років.педіатр.патології.лабораторія.ліки.17, 1–25 (1997).
Мангольд Е., Людвіг К.У. та Нотен М.М. Прорив у генетиці орофаціальних щілин.Тенденції в молекулярній медицині 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Міну, М. і Райлі, Ф. М. Молекулярні механізми міграції клітин черепного нервового гребеня та формування візерунка під час розвитку черепно-лицевої тканини.Розробка 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Діксон, М. Дж., Маразіта, М. Л., Біті, Т. Г. і Мюррей, Дж. К. Заяча губа та піднебіння: розуміння генетичних і екологічних впливів.природний коментар.Генетика 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR та ін.Аномальний морфогенез шкіри, кінцівок і черепно-лицьової області у мишей з дефіцитом фактора-6 (Irf6), що регулює інтерферон.National Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. та ін.Домінуючі мутації в GRHL3 спричиняють синдром ван дер Ваорда та порушують розвиток перидерми порожнини рота.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Харріс, MJ та Juriloff, DM Оновіть список мишачих мутантів з дефектами закриття нервової трубки та прогрес до повного генетичного розуміння закриття нервової трубки.Дослідження вроджених вад.Частина A, клінічна та молекулярна тератологія 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-опосередкована передача сигналів PDGFRalpha регулює виживання та проліферацію в розвитку скелета через p53-залежний внутрішньоклітинний шлях.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Копп, А. Дж., Грін, Н. Д. і Мердок, Дж. Н. Розпатланий: Зв’язок конвергентного розширення з закриттям нервової трубки.Тенденції розвитку неврології.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).