347 Хімічний компонент трубки з нержавіючої сталі, Ідентифікація нових інтерферонських лейкоцитарних антигенів-A (HLA-A) білків шаперону з використанням зшитого мас-спектрометрії (CLMS)

Дякуємо, що відвідали Nature.com.Ви використовуєте версію браузера з обмеженою підтримкою CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Крім того, щоб забезпечити постійну підтримку, ми показуємо сайт без стилів і JavaScript.
Повзунки, що показують три статті на слайді.Використовуйте кнопки «Назад» і «Далі» для переходу між слайдами або кнопки керування слайдами в кінці для переходу між слайдами.

Опис продукту

Змійовики з нержавіючої сталі 347L, марка сталі: SS347L

Система інтерферонної сигналізації викликає сильну цитокінову реакцію на широкий спектр патогенних та внутрішніх патологічних сигналів з навколишнього середовища, що призводить до індукції підмножин білків, що індукують інтерфероном.Ми застосували мас-спектрометрію, опосередковану DSS (CLMS) для виявлення нових білко-білкових взаємодій у домені білків, спричинених інтерфероном.На додаток до очікуваних індукованих інтерфероном білків, ми також виявили нові міжмолекулярні та внутрішньомолекулярні зшиті аддукти канонічних інтерферону, індукованих білками, такими як MX1, USP18, OAS3 та STAT1.Ми зосередилися на ортогональній валідації нового набору інтерферону-індукованих білкових мереж, утворених білками HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) з використанням спільної імунопреципітації та їх подальшому дослідженні з використанням моделювання молекулярної динаміки.Моделювання конформаційної динаміки білкового комплексу виявило кілька сайтів взаємодії, які відображали взаємодії, виявлені в результатах CLMS.Разом ми представляємо пілотне дослідження CLM для виявлення нових сигнальних комплексів, індукованих інтерфероном, і сподіваємось на більш широке використання CLM для виявлення нової динаміки білкових взаємодій у мікросередовищі пухлини.
Перед тим, як розпочнеться адаптивна імунна відповідь, вроджена оборонна система господаря встановлює антимікробну відповідь, опосередковану сімейством виділених альфа-спіральних цитокінів, що називаються інтерфероном (ІФН).Класи IFN типу I IFN α та IFNβ активують клітинні реакції, включаючи противірусні, проапоптотичні, прозапальні та антипроліферативні стани.У людини відомі 13 підтипів IFNα, все це кластеризується на хромосомі 91. Дивно, але лише IFNα2 вивчався для клінічного використання.Нещодавно особливу увагу приділяли дослідження інших підтипів IFNα.Недавнє дослідження показало, що IFNα14 є однією з найбільш ефективних ізоформ у обмеженні реплікації HBV2 та ВІЛ-13,4 порівняно з канонічним підтипом IFNα2.
Встановлено, що активовані комплекси рецепторів інтерферону типу I (IFNAR1 та IFNAR2) викликають каскад трансдукції сигналу, опосередковані кіназами Janus Kinases Tyk2 та JAK15,6.Ці кінази Janus фосфорилюють перетворювачі сигналу та активатори транскрипції білка (STAT1 та STAT2) на залишки тирозину для ініціювання гетеродимеризації, опосередкованої доменом SH2.Згодом IRF9 зв'язує гетеродимери STAT з утворенням тримерного комплексу гена стимульованого IFN фактора 3 (ISGF3), який переміщується в ядро ​​і індукує транскрипцію понад 2000 генів, стимульованих інтерфероном (ISGS) 5,6,7,8.
ISG утворюють основу вродженої імунної системи, особливо у відповідь на вірусну атаку.Як перша лінія захисту від вірусної інфекції, клітини швидко розгортають велику взаємодію клітинних білків з широким спектром біологічної активності.Ці білки включають рецептори розпізнавання закономірності, сигнальні молекули, фактори транскрипції та білки з прямими противірусними функціями, а також негативними регуляторами імунних реакцій9.Значна частина інформації про активність ISG надходить з функціональних екранів з використанням екранів надмірної експресії10,11 або методів замовчування генів (siRNA, RNAi та CRISPR) 12,13, в яких індивідуальні ІСГ експресуються або гальмуються, і їх активність перевіряється на різних вірусах.Хоча ці дослідження визначали противірусні властивості окремих ІСГ, основні молекулярні механізми кожного ISG залишаються значною мірою невідомими.Загальновизнано, що багато білків взаємодіють з одним або декількома цитокінами, щоб забезпечити повну активність, тому або ISG взаємодіють безпосередньо, або їх взаємодія опосередковується клітинними білками.Наприклад, нещодавнє фотокасоване дослідження протеоміки визначило АТФазу VCP/P97 як головний партнер взаємодії IFITM3, гальмування якого призводить до дефектів лізосомального сортування, обороту та котранспорту IFITM3 з вірусними частинками 14.Використовуючи імунопреципітацію, ми визначили VAPA, асоційований з везикулями білок, як партнер взаємодії з IFITM1/2/3, який опосередковує дозрівання вірусу, опосередкованого холестерином, і це було підтверджено іншим дослідженням за допомогою дріжджової двогібридної системи.Наукова підтримка 15, 16.
Основним біологічним процесом, що бере участь у придушенні інфекції та злоякісної трансформації, є подання антигену, яка опосередковується основними молекулами комплексу гістосумісності (MHC).Пептиди (8-12 амінокислот довжиною) від розщеплених, передчасно закінченими або неправильно складеними білками завантажуються в гетеродимер MHC-I (що складається з важких і легких ланцюгів MHC-I, що називаються β-2-мікроглобуліном; β2M) 17,18.Отримані стабільні тримери MHC-I транспортуються до клітинної поверхні, де вони представляють внутрішньоклітинні пептиди до клітин CD8+ Т (цитотоксичних Т-клітин) 17.Т-клітини розпізнають і знищують ці збудники та клітини, що несуть специфічний для пухлини антиген.Отже, збудники та пухлинні клітини часто пригнічують процес подання антигену, щоб уникнути імунного спостереження.Крім того, MHC-I знижується у 40-90% пухлин людини і часто пов'язаний з біднішим прогнозом19.
Гени, що беруть участь у реагуванні на патогени, повинні швидко перемикатися між станом спокою та станом активної транскрипції.Тому гіпотезується декілька клітинних білків, які беруть участь у відповіді на високий попит IFN протягом коротких періодів часу, включаючи ремоделювання та модифікацію промоторного хроматину 20,21.Більшість досліджень були зосереджені на ідентифікації окремих білкових партнерів ISG в присутності IFN.Кілька протеомічних та транскриптомічних досліджень у модельних клітинних системах з'ясували вплив IFN на клітинний ландшафт.Однак, незважаючи на зростаюче розуміння динаміки, спричиненої інтерферонами, ми все ще мало знаємо про участь ISG.Розглядаючи складність та залежну від часу динаміку інтерферону сигналізації, виникають два питання: (i) Чи можна стабілізувати та захопити багатопротеїнові комплекси, що беруть участь у швидкій сигналізації, та (ii) чи можуть ці взаємодії бути відображені на 3D-простір?
Для вирішення цих питань ми реалізували хімічне зшивання, що опосередковується Disuccinimide (DSS) у поєднанні з мас-спектрометрією (CLMS) для вивчення мережі взаємодії білка, спричиненої IFNα та її динаміки.DSS додає ковалентні зв’язки між проксимальними залишками білків та/або білкових комплексів in vivo.Подальший аналіз МС виявляє конкретні зшивання ділянок, що відображають просторову близькість областей у певному білку, що називаються внутрішніми зв'язками або субодиницями в білкових комплексах, що називаються взаємозв'язками.Використовуючи такий підхід, ми виявили кілька нових білко-білкових комплексів, а також індукованих інтерфероном мереж взаємодії.Подальшим тестуванням підмножини цих нових взаємодій ми демонструємо, що H2BFS (H2B Histone-Type FS; далі-H2B) та MDN1 виступають як прив'язні партнери для HLA-A.
Клітини FLO-1-одна з найвідоміших моделей in vitro аденокарциноми стравоходу, оскільки вони імітують ключові особливості пухлин стравоходу22,23.Однак не всі пухлини є імуногенними, і щоб визначити, чи реагують клітини FLO-1 на лікування інтерфероном, ми обробляли клітини FLO-1 10 нг/мл IFNα протягом 72 годин.Клітини FLO-1 показали ранню індукцію PSTAT1 та IRF1, починаючи з 2 годин після лікування та продовжуючи протягом 72 годин, із залежним від часу зниженням стаціонарних рівнів IRF1 (рис. 1А).Було виявлено, що ISGS (MX1, IFITM1, OAS1/2 та ISG15) сильно індукуються через 6 годин, імітуючи класичні реакції середньої та пізньої фази на IFNα (мал. 1А).Разом ці дані говорять про те, що ця стільникова модель може бути використана для вивчення відповідей інтерферону.
Диференціальні реакції експресії білка в клітинах FLO-1 після лікування IFNα.(A) Експресія білка в клітинах FLO-1, оброблених 10 нг/мл IFNα протягом 2, 6, 24, 48 та 72 годин, аналізували імуноблотом за допомогою зазначених антитіл ISG.(B) Coomassie Blue забарвлені гелі SDS-PAGE цілих клітинних екстрактів після зшивання з DSS для зазначених часів та концентрацій.(C) Репрезентативне імуноблот, досліджується з антитілом p53 (DO-1) з тих же зразків для оцінки ступеня зшивання білка.
Для захоплення ландшафту взаємодії білка in situ ми використовували DSS, широко використовуваний зшиваючий засіб через його високу мембранну проникність та відносно короткий час реакції.Більш короткий час реакції допомагає запобігти утворенню великих агрегатів зшитого білків, тим самим підтримуючи стабільність зшивання.Щоб визначити оптимальну концентрацію DSS та уникнути надмірного розгортання, ми спочатку піддали клітини до 5, 2,5 та 1 мм DSS протягом 5, 10, 5 та 30 хвилин відповідно, і проаналізували лізати, пофарбовані Кумассі SDS-PAGE (Дані не показані).Клітинні лізати, схоже, сильно пов'язані з найнижчою концентрацією та в найкоротший момент часу.Тому DSS титрували до 1, 0,5 та 0,1 мм протягом 5 хвилин (рис. 1В).Оптимальне зшивання спостерігалося з 0,5 мМ DSS протягом 5 хвилин, і ці умови були обрані для клітин, оброблених IFNα.Крім того, на малюнку 1c показано вестерн-блот, проведений за допомогою антитіла P53 (DO-1) для оцінки ступеня зшивання білка.
Клітини FLO-1 обробляли 10 нг/мл IFNα протягом 24 годин до додавання зшивання.Звершенні клітини згодом лізирували двоступеневим протеолізу, а білки обробляли за допомогою FASP (рис. 2) 24,25.Поперечні трійки-пептиди аналізували за допомогою мас-спектрометрії (рис. 2).Потім спектри MS/MS узгоджуються з послідовністю білка і кількісно визначають MaxQuant26,27.Зшиті пептиди були ідентифіковані з отриманих спектрів за допомогою програми SIM-XL, а окремі сполуки поєднувались у складну мережу за допомогою обчислювальних програм з відкритим кодом XQuest28 та SIM-XL29 (рис. 2).SIM-XL ідентифікує взаємодії білко-білок, внутрішні ланцюги та окремі ланцюги у простих або складних білкових сумішах та забезпечує сценарії для візуалізації взаємодій у білкових структурах.Крім того, він класифікує кожну перехресну зміну як оцінку ідентифікатора відповідно до якості спектру MS/MS29.Було виявлено декілька високодорожніх взаємодій та комплексів білок-білок, і новий набір взаємодій був додатково досліджений за допомогою спільної імунопреципітації та конформаційних змін комплексів з використанням моделювання молекулярної динаміки (MD) (рис. 2) 30, 31.
Схематичний огляд методу CLMS.Клітини FLO-1 обробляли 10 нг/мл IFNα протягом 24 годин з подальшим зшиванням білка in situ за допомогою DSS з подальшим лізисом клітин та трипсинізацією.Зсувні зразки аналізували за допомогою мас-спектрометра Orbitrap і подальше відібрано для фрагментації пептидних попередників під час LC-MS/MS.Два пов’язані пептиди були ідентифіковані з отриманих спектрів за допомогою машини розпізнавання спектру з пошкоджених пептидів (SIM-XL), і всі сполуки поєднувались у складну мережу за допомогою обчислювальних трубопроводів.Відфільтруйте низькі взаємодії з довірою на основі балів помилкових позитивних показників (FDR).Далі було підтверджено кілька нових взаємодій білка-білка з високою точністю за допомогою спільної імунопреципітації, а конформаційні зміни комплексів були досліджені за допомогою моделювання молекулярної динаміки (MD).
Всього ~ 30 500 та ~ 28 500 пептидів були виявлені за допомогою MaxQuant у нестимульованих та стимульованих зразках IFNα відповідно (додаткова таблиця S1, рис. 3А).Розподіл довжини пептиду в обох випадках показав більшу частку більших пептидів, що вказує на наявність зшитого пептидів (рис. 3В, С).Крім того, більша частка більших пептидів була присутня в діапазоні 40–55 у зразках, оброблених IFNα (рис. 3в).Картографування білка проти інтенсивності LOG2 показало, що класичні інтерферону-стимульовані білки були найбільш рясними порівняно з необробленими зразками, включаючи MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 та HLA-F (мал. 3D).Аналіз шляхів для білків більше трикратних збагачених у відповідь на лікування IFNα за допомогою бази даних реактивного шляху показав, що представлення та обробка антигену, опосередкованого MHC-I, був найбільш домінуючим шляхом (мал. 3е).Відповідно до попередніх звітів, антивірусні реакції, опосередковані OAS та ISG15, а також IFNα/β та цитокіновою сигналізацією, були серед активних шляхів.Крім того, лізин- та серинові білкові зшивання білка були ідентифіковані з спочатку придбаних спектрів MS/MS за допомогою SIM-XL.Недавнє дослідження повідомило про 104 ISG, що охоплюють 20 вірусів з 9 класів вірусів за метааналізом окремих досліджень надекспресії ISG у 5 типах клітин9.Однак для подолання обчислювальних обмежень скринінгу великих наборів даних ми розпочали з меншого набору даних для вивчення можливих взаємодій між списком генів IRDS, про які повідомляли Padaria et al., Більшість з яких - ISG.
Ідентифікація диференційно експресованих зшитих білків у відповідь на IFNα (дані, отримані з MaxQuant).(A) Діаграма Венна, що представляє кількість загальних та ексклюзивних пептидів, ідентифікованих у оброблених IFNα14 та нелікованих зразках FLO-1.Розподіл довжини пептиду нелікованих (B) та оброблених IFNα (c) зшитого зразки.(D) Теплова карта, що представляє LOG2 (інтенсивність LFQ) між необробленими та обробленими IFNα14 клітинами FLO-1.Ліва панель показує білки, які найбільш активно активуються в присутності IFNα.(E) Гістограма, що представляє 20 основних шляхів збагачення після лікування IFNα.База даних про реакцію проаналізувала понад чотириразові зміни в регульованих білках, що реагують на IFNα.
Стимуляція ISG, опосередкована інтерфероном, добре зафіксована, але на молекулярному рівні недостатньо зрозуміло, як ці білки завершуються широким діапазоном біологічних функцій.Ми досліджували взаємодії білка з високим ступенем довіри між відомими ISG.Цікаво, що ми визначили мережу, включаючи білки MX1, USP18, ROBO1, OAS3 та STAT1, які утворюють великий комплекс у відповідь на лікування IFNα (рис. 4, Таблиця S2) 32,33,34.Найголовніше, що ці взаємодії були виявлені у всіх трійках, оброблених IFNα, і їх не було виявлено у нелікованих зразках, що дозволяє припустити, що вони утворюються спеціально у відповідь на лікування IFNα.Відомо, що STAT1 транскрипційно регулює експресію цих ISG, але його взаємодія з ISG на рівні білка не вивчена.Кристалічна структура STAT1 показала, що його спіральний домен (CCD) не бере участь у взаємодії з ДНК або протомерами під час утворення димерів35.Ці α-спіралі утворюють спіральну структуру спіралі, яка забезпечує переважно гідрофільну площу поверхні для взаємодії 35.У наших даних про CLMS ми спостерігали, що більшість взаємодій зі STAT1 відбулися в домені SH2, що передує CCD, домену лінкера або хвоста С-кінця (залишки 700-708) (мал. 4А).Попереднє дослідження повідомляло, що USP18 зв'язується з CCD та ДНК-зв'язуючим доменом (DBD) STAT2 і набирається до субодиниці рецептора інтерферону IFNAR2 типу I для опосередкування інгібування сигналу 24 типу I.Наші дані також показали, що каталітичний домен USP18 взаємодіє зі STAT1 DBD (рис. 4А, D), що дозволяє припустити, що і STAT1, і STAT2 можуть відігравати роль у залученні USP18 до IFNAR2.
Мережа білок-білка ISG, ідентифікована в зшитого клітини, оброблених IFNα.(A) 2D графік взаємодії, що показує взаємодію білка-білок (генерується в програмі SIM-XL), при цьому лінії представляють міжмолекулярні взаємодії (відсікання зшивання, встановлене на 3,5).Домени різних ідентичностей позначаються їх кольором32: MX1 доменом, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) та GED (569–660).Домени OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_TRANSF_2 (780-872) та OAS1_C (903-108).Domain Robo1, IG_3 (67–151), I-SET (170–258), I-SET (262–347), IG_3 (350–432), IG_3 (454–529), FN3 (562–646), FN3 (678–758) та FN3 (777–864).Поля STAT1: STAT_INT (2–120), STAT_ALPHA (143–309), STAT_BIND (321–458), SH2 (573–657) та STAT1_TAZ2BIND (715–739).(B) Круглий глядач зшитого білків (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 та STAT1) з взаємодіями та взаємодіями, позначеними синім та червоним кольором відповідно.Поріг поперечної зв'язку був встановлений на 3,5.Діаграми DOT вказують на сайти взаємодії STAT1 з MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) та OAS3 (F), а також сайтами взаємодії K або S між двома пептидами.На малюнку поріг поперечної лінії встановлений на 3,0.(G) різні ділянки взаємодії між доменами STAT1 та OAS3 DI, накладеними на їхні білкові структури в Pymol (Pymol Molecular Graphics System, версія 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (PDB ID: 1BF533) та OAS3 (PDB ID: 4S3N34).
Дві ізоформи USP18 були описані у людини, повнометражний білок, який знаходиться переважно в ядрі, і ізоформу без N-кінцевого домену, USP18-SF, який рівномірно розподіляється в цитоплазмі та ядрі 36.Крім того, прогнозувалося, що N-кінець буде неструктурованим і не вимагає активності ізопептидази або зв'язування ISG1537.Більшість взаємодій, виявлених у нашому дослідженні, були розташовані на N-кінці білка, що дозволяє припустити, що ці взаємодії включають в себе повну довжину USP18 (мал. 4А, D) і, таким чином, ймовірно, що виникають у ядрі.Більше того, наші дані також вказують на те, що N-кінець спеціалізується на взаємодії білка до білок.Сайт зв'язування IFNAR2 розташований між залишками 312-368, і, зокрема, жоден з білків у комплексі не зв'язується з цією областю (рис. 4А) 37,38.Ці дані, взяті разом, вказують на те, що домен зв'язування IFNAR2 використовується виключно білком рецептора.Крім того, було виявлено, що лише OAS3 та ROBO1 асоціюються з доменами вище за течією N-кінцевого та IFNAR2-сайту (мал. 4А).
ROBO1 належить до надсімейства імуноглобуліну (IG) трансмембранних сигнальних молекул і складається з п'яти доменів IG та трьох доменів фібронектину (FN) у позаклітинній області.Ці позаклітинні домени супроводжуються мембранно-проксимальною областю та єдиною трансмембранною спіральною 39. Неструктурована внутрішньоклітинна область розташована на С-кінці і містить збережену послідовність послідовностей, які опосередковують зв'язування білка ефектора39.Область, що простягається від амінокислот ~ 1100 до 1600, здебільшого невпорядкована.Ми виявили, що MX1 взаємодіє з ROBO1 через IG, FN та внутрішньоклітинні домени, тоді як більшість взаємодій зі STAT1 відбувається між його CCD, доменом лінкера та С-кінцем ROBO1 (рис. 4А, Е).З іншого боку, взаємодії з ділянками Linker DI, DIII та OAS3 розподілялися по всьому білку ROBO1 (рис. 4А).
Сімейство білків олігоаденилатної синтази (OAS) приймає та зв'язує внутрішньоклітинну дволанцюжкову РНК (DSRNA), зазнає конформаційних змін та синтезує 2 ', 5'-пов'язані олігоаденлатили (2-5 AS) 40.Було встановлено, що серед трьох OASS OAS3 виявляє найвищу спорідненість до DSRNA і синтезує найменшу кількість 2-5 як, що може активувати RNase L і тим самим обмежувати вірусну реплікацію 41.Сімейство OAS складається з полімеразних бета-бета (Pol-β) нуклеотидних доменів трансферази.Попередні дослідження показали, що каталітична активність С-кінцевого домену (DIII) залежить від домену, що зв'язує DSRNA (DI), який необхідний для активації OAS342.Ми спостерігали, що домени DI та DII OAS3 взаємодіють з CCD та невеликою областю перехрестя між SH2 та STAT1 TAD (мал. 4А, F).Накладка різних ділянок зшивання на структурі білка виявила взаємодію між β-листком та петлею DBD STAT1 та відкритою кишеню або порожниною, утвореною залишками 60–75 у домені OAS3 (рис. 4G).Орієнтація білків у комплексі також показала, що жодна з взаємодій з OAS3 не заважала ДНК-зв'язуючій здатності його домену DI (рис. S1A).Крім того, N-кінцевий домен GTPase MX1 широко взаємодіє з доменами DI та DIII OAS3 (рис. 4А).Ми також спостерігали взаємодію між OAS1 та MX1 у всіх трьох повторних повторах IFNα, де один домен OAS1 (також каталітично активний) взаємодіє з усіма трьома доменами MX1 (мал. S2A, B).
MX білки є частиною великого сімейства динеїноподібних GTPases, які містять N-кінцевий домен GTPase, який зв'язує та гідролізує GTP, проміжний домен, який опосередковує самостійне складання, і С-кінцева лейцинова блискітка, яка діє як GTPase (LZ .).Домен ефектор домен25,43.MX1 зв'язується з субодиницями вірусних полімераз для блокування транскрипції вірусного гена43.Раніше повідомлений дріжджовий двогібридний екран показав, що асоційований з PIAS1 MX1 інгібує активацію гена, опосередкована STAT1, блокуючи активність ДНК-зв'язуючі, а також має активність лігази SUMO E344,45.Тут ми демонструємо, що MX1 зв'язується зі STAT1 (рис. 4С, D), однак, як ця взаємодія впливає на активацію гена, опосередкованої STAT1 у відповідь на IFNα, потребує подальшого вивчення.Крім того, ми також виявили, що MX1 взаємодіє з IFIT3 та DDX60 у всіх трьох повторних повторах IFNα (рис. S2C).
DDX60-це індукована IFN цитоплазматична геліказа, яка раніше повідомлялося, що відіграє роль у незалежній від RIG-I-деградації вірусної РНК46.Він взаємодіє з RIG-I і активує свою сигналізацію специфічним для ліганду 46. DDX60 складається з домену гелікази DEXD/H-Box та домену С-кінцевої гелікази, які зв'язують вірусну РНК та DNA47.Більшість його взаємодій з MX1 та IFIT3 відбувається в довгих N- та С-кінцевих областях без канонічних доменів або мотивів (рис. S2E, F).Однак MX1 також асоціюється з доменом гелікази DEXD/H-Box (рис. S2E).Білки сімейства IFIT мають тандемні копії виразного мотиву спіралі-повороту, що називається повторенням тетрапептиду (TPR).IFIT3 виявився позитивним модулятором сигналізації RIG-I і, отже, компонентом комплексу MAVS.У сукупності наші дані говорять про те, що IFIT3 та DDX60 взаємодіють насамперед у області між TPR 3–6 IFIT3 і можуть відігравати роль у сигналізації RIG-I/MAVS (рис. S2F).
Враховуючи, що скринінг весь протеом є обчислювально інтенсивним, ми перевіряли всю людську базу даних Uniprot на наявність одного з повторених IFNα.У цій репліці ми знайшли кілька високодорожніх мереж взаємодії для HLA-A.Аналіз білкових шляхів, ідентифікованих за допомогою спектрів MS/MS, показав, що обробка та презентація на основі MHC-I на основі MHC-I є основним шляхом, індукованим інтерфероном (рис. 3D).Тому ми зосередилися на вивченні білкових взаємодій молекул MHC-I з високим ступенем впевненості у всіх зшитого зразка.HLA складається з доменів α1, α2 та α3 та світлових ланцюгів, а мікроглобуліну β2 (β2M) є постійним шапероновим білком49.Після того, як зібраний в ендоплазматичному ретикулумі, HLA нестабільна за відсутності пептидних лігандів50.Пептид-зв'язуюча канавка утворюється високо поліморфними та неструктурованими доменами α1 та α2 у непептидній формі та відносно менш поліморфним доменом α351.У присутності IFNα ми виявили два комплекси HLA-A: одна взаємодіє з HMGA1 та H2B (мал. 5, табл. S3), а інша взаємодіє з MDN1, LRCH4 та H2B (мал. 6).
IFNα індукує мережу взаємодії HLA-A з H2B (H2BFS) та HMGA1.(A) 2D графік (генерований у програмному забезпеченні SIM-XL) із зображенням різних типів взаємодій у комплексі H2B-HLA-A-HMGA1: Інтерлінк (синій), інтерлінк (червоний) та одиночний зв’язок (чорний)..Домени різних ідентичностей-це кольорове кодування32: H2B (гістон; 2–102) та MHC-I (MHC_1; 25–203, група C1; 210–290 та MHC_I_C; 337–364).Поріг поперечної зв'язку був встановлений на 3,5.Діаграми DOT вказують на сайти взаємодії HLA-A з H2B (B) та HMGA1 (C), а також ділянками взаємодії K або S між двома пептидами.На малюнку поріг поперечної лінії встановлений на 3,0.(D) Взаємозв'язки між білками, показаними в структурах білків H2B, HLA-A та HMGA1 у програмі Pymol.Ці структури моделювали за допомогою сервера Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2), а структури шаблонів для білків H2B, HLA-A та HMGA1 були 1KX552, 1KJ349 та 2EZE55 відповідно.
IFNα індукує мережу взаємодії HLA-A з H2B (H2BFS), MDN1 та LRCH4.(A) Внутрішньомолекулярні (червоні) та міжмолекулярні (сині) зшивання, представлені на 2D-інтерактивній карті (генеруються в програмному забезпеченні SIM-XL) з MDN1, представленим у вигляді кола.Поріг поперечної зв'язку був встановлений на 3,5.Домени різних ідентичностей є кольоровими кодами32: H2B (гістон; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, група C1; 210–290 та MHC_I_C; 337–364) та LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) та CH (535–641)).(B) Взаємозв'язки між білками, показаними в структурах білків H2B, HLA-A, LRCH4 та MDN1 у програмі Pymol.Ці структури моделювали за допомогою сервера Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) з структурами шаблонів 1kx552, 1kj349, 6hlu62 та 6i2665 для білків H2B, HLA-A, LRCH4 та MDN1, HLA-A, LRCH4 та MDN1 respectively.Діаграми крапки, що показують сайти взаємодії K або S для HLA-A з H2B (C), LRCH4 (D) та MDN1 (E).Для сюжетів поріг поперечної ланки був встановлений на 3,0.
Окрім підтримки цілісності геному, гістон H2B також бере участь у регуляції транскрипції.Білок H2B складається з центрального домену гістону (HFD), утвореного трьома α-спіралами, розділеними петлями та С-кінцевим хвостом 41,52.Більша частина взаємодії з H2B відбувається в спіралі α1, що забезпечує тримеризацію гетеродимером HFD (рис. 5А, б).Хоча лізини беруть участь у зв'язуванні ДНК, деякі лізини також є альтернативними ділянками ацетилювання або метилювання.Наприклад, залишки K43, K46 та K57 від H2B не беруть участь у прямому зв'язуванні ДНК, а є цілями різних посттранскрипційних модифікацій53.Аналогічно, залишки K44, K47 та K57 в H2B можуть відігравати альтернативну роль у присутності IFNα, включаючи взаємодію з іншими білками (рис. 5А, Б).Крім того, екстрахромосомний гістон H2B активує імунну відповідь у різних типах клітин, діючи як цитозольний датчик для виявлення фрагментів з дволанцюжками ДНК (DSDNA), отриманими з інфекційних агентів або пошкоджених клітин54.У присутності вірусів ДНК виснаження H2B гальмувало вироблення IFN-β та фосфорилювання STAT154.H2B також, як відомо, рухається в ядрі та поза ними швидше, ніж інші основні гістони54.Взаємодія H2B з MDN1 та LRCH4 також спостерігалася у вибраних нелікованих зразках.Ми виявили, що HLA-A взаємоділа з H2B у всіх трьох зразках, оброблених IFNα, і в одному нелікованому зразку повторних.Ці дані відображають роль H2B в альтернативній фізіологічній функції, незалежно від регуляції транскрипції.
HMGA1 (група з високою мобільністю AT-Hook 1), невеликий нуклеопротеїн, багатий на амінокислоти, що сприяє захворюванням, була ідентифікована у поєднанні з HLA-A.Він має кислий С-кінцевий хвіст і три чіткі DBD, які називаються на гачках, оскільки вони зв'язуються з незначною канавкою області, багатих АТ в DSDNA55,56.Це зв'язування призводить до того, що ДНК згинається або випрямляється, що дозволяє канонічним фактором транскрипції отримати доступ до її послідовності консенсусу.Вважається, що С-кінцевий хвіст бере участь у взаємодії білко-білок та наборі факторів транскрипції, оскільки мутанти делеції С-кінцевого делеції не в змозі ініціювати транскрипцію57.Більше того, цей домен містить кілька збережених місць фосфорилювання, які є відомими субстратами для кіназ 58.Ми спостерігали взаємодії HLA-A та H2B з HMGA1 поза С-кінцевим доменом, що дозволяє припустити, що С-кінцевий домен в основному використовується для зв'язування фактора транскрипції (рис. 5А, С).Білки HMGA конкурують з гістоном H1 за зв'язування з адаптерною ДНК, тим самим збільшуючи доступність57.Аналогічно, мабуть, HMGA взаємодіє з гістоном H2B вздовж ДНК лінкера в конкуренції з гістоном H1.HMGB1 індукує експресію HLA -A, -B та -C в дендритних клітинах, що призводить до їх активації59, але взаємодію між HMG та HLA раніше не повідомлялося.Ми виявили, що HMGA1 взаємодіє з доменами α1 та α3 HLA-A, з більшістю взаємодій поза його 3 дБд (мал. 5А, С).У наших руках було виявлено, що HLA-A локалізується в ядрі (дані не показані), і враховуючи, що H2B та HMGA1 також присутні в ядрі, ця взаємодія, ймовірно, виникає в ядрі.Конкретні аддукти, виміряні між H2B, HLA-A та HMGA1, показані на малюнку 5D.
Більшість взаємодій HLA-A з іншими білками відбуваються в його доменах α1 та α2 та невпорядкований С-кінцевий домен (рис. 6).В одному з цих прикладів ми виявили, що HLA-A взаємодіє з невпорядкованим N-кінцевим хвостом LRCH4 (мал. 6а, D).LRCH4 регулює активацію TLR4 та індукцію цитокінів LPS, тим самим модулюючи вроджену імунну відповідь6,61.Це мембранний білок з дев'ятьма повтореннями, багатими лейцином (LRRS) та мотивом гомології кальмодуліну (СН) в ектодоменаїні з подальшим трансмембранним доменом (TMD) 60, 62.Повідомлялося, що домени CH мають посередницьку взаємодію білка-білок 60.Розтягнення близько 300 амінокислот між доменами LRR та CH відносно доступна, але невпорядкована.Виходячи з функції невпорядкованих областей як медіаторів білкових білкових мереж та везикулярного транспорту 63, ми виявили, що більшість взаємодій білка трапляються в невпорядкованих регіонах.Взаємодії з MDN1 розподілялися по всій довжині білка, включаючи домени LRR1, LRR6, CH та випадкові області, тоді як H2B в основному пов'язані з доменом CH (рис. 6а, б).Зокрема, жодна з взаємодій не включала TMJ, що говорить про специфічність підходу CLMS (мал. 6а, б).
MDN1 також був ідентифікований як частина білкової мережі HLA-A (мал. 6а).Він належить до сімейства білків AAA (АТФази, пов'язані з різною діяльністю).Це той самий N-кінцевий домен AAA, який організовує в гекзамерному кільці і видаляє коефіцієнт складання з 60-х 64 рибосомальної субодиниці.Крім того, область, багатий ASP/GLU, супроводжується доменом MIDAS (місце залежного від металу іон).Ми ідентифікували HLA-A, H2B та LRCH4 як партнери, що зв'язують MDN1, і виявили їх орієнтацію як білкові комплекси в Пімолі (рис. 6а, б).Ці три білки взаємодіють із доменом AAA, доменом, що нагадує динеїн, і, можливо, доменом Midas MDN1.У попередньому звіті очищення спорідненості білків приманки ідентифікували MDN1 як білок, пов'язаний з гістоном H2B67.Ідентифікація цього комплексу у зразках, оброблених IFNα, говорить про роль MDN1 в інтерферону.
Оскільки гени HLA є високо поліморфними, ми витягнули послідовність зчитування зчитування відображення HLA -A, -B та -C з даних секвенування РНК клітин FLO -1 (дані не показані).Пептидні послідовності, що відповідають зчитуванню послідовності, виявили значні відмінності між HLA-A, -B та -C в регіонах, де зшиті пептиди розташовувались у HLA-A (мал. S3).Крім того, ми не спостерігали зшивання білків до білка молекул HLA-B/C з білками H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Це говорить про те, що взаємодія білка, виявлена ​​між HLA-A, MDN1, LRCH1 та HMGA1, є специфічною для HLA-A.Крім того, протеомічний аналіз неперешкодних зразків (табл. S4) показав, що HLA-A має більш високе покриття послідовності порівняно з HLA-B або HLA-C.Пептиди, ідентифіковані для HLA-A, були високою інтенсивністю як у зразках, оброблених IFNα, так і у нелікованих зразках.
Щоб переконатися, що взаємодії, визначених тут, не були пов’язані з неспецифічним зшиванням двох білків у близькій просторовій близькості, ми додатково підтвердили два нових взаємодіючих факторів HLA-A, проводячи спільні імунопреципітаційні аналізи.Взаємодії HLA-A з ендогенними MDN1 та H2B були виявлені як у клітинах, оброблених IFNα, так і у нелікованих клітинах FLO-1 (мал. 7, рис. S4).Ми підтвердили, що HLA-A був захоплений H2B в імунопреципітатах і що ця асоціація була обумовлена ​​лікуванням IFNα, оскільки HLA-A відсутня у зразках імунопреципітату з необроблених клітин (мал. 7А).Однак наші дані говорять про те, що IFNα диференційно регулює зв'язування HLA-A з H2B та MDN1.IFNα індукує зв'язок між H2B та HLA-A, але зменшує його асоціацію з MDN1.Ми виявили, що MDN1 асоціюється з HLA-A в контролях, а додавання IFNα зменшило цю взаємодію незалежно від індукції MDN1 IFNα (мал. 7б, С).Крім того, імунопреципітація HLA-A захопила H2B в клітинах A549 (рис. S4), що дозволяє припустити, що ця взаємодія не залежить від типу клітин.У сукупності ці результати підтримують інтерферон-опосередковані взаємодії HLA-A з H2B та MDN1.
HLA-A CO-Purifies H2B та MDN1.Репрезентативні ендогенні H2B (A) та MDN1 (B) імуноблоти імунопреципітували з клітин FLO-1, оброблених IFNα, і досліджували для зазначених антитіл.Миша та кролика IgG використовували як негативний контроль.(C) Відносні кількості (вхід) різних антигенів зображуються імуноблотами, зондивими проти зазначених антитіл, β-актин використовували в якості контролю навантаження.
Були досліджені структурні властивості однієї з індукованих інтерфероном високодорожніх зшитого мереж, H2B-HLA-A-HMGA1.Ми використовували моделювання молекулярної динаміки як альтернативний підхід для розуміння конформаційної динаміки білків, що беруть участь у цьому комплексі (мал. 8).Висновки з даних CLMS говорять про можливість різних конформацій білків H2B, HLA-A та HMGA1.Тому наступні потенційні комплекси були модельовані в середовищі розчинника: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A та H2B-HLA-A-HMGA1.Початковий екран док-білка-білок з використанням MOE (молекулярне робоче середовище; хімічна обчислювальна група Inc., Монреаль, Квебек, Канада) запропонував можливі конформації, що відрізняються між цими білками (рис. 8А).Візуалізація стикувального білкового комплексу виявила кілька взаємодій та можливих конформацій (мал. 5а, 8).Таким чином, одна можлива конформація показана на малюнку 8А (з міченими поперечними зв'язками), і вона була додатково оцінювалася за допомогою трубопроводу моделювання MD.Крім того, зв'язування H2B або HMGA1 з HLA-A підкреслює більш високу спорідненість H2B для HLA-A (рис. 8а).
Конформаційна динаміка можливих мереж між комплексами H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A та H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Ліва панель-це 2D-карта (генерована в програмному забезпеченні SIM-XL) внутрішньомолекулярних (червоних) та міжмолекулярних (синіх) зшиваннях (CrossLink Cutoff встановлений на 3,5).Крім того, ідентифіковані зшивання залишків позначені на структурах білків H2B, HLA-A та HMGA1.Супутні конформації цих білків були вилучені за допомогою док -док -трубопроводу, реалізованого в пакеті МО.Нижня ліва панель показує різні можливі конформації комплексів H2B-HLA-A та HMGA1-HLA-A з різними спорідненими білковими білками (GBVI/WSA DG; KCAL/MOL).(B) Стандартне відхилення (RMSD) атомних положень (за винятком атомів водню) для кожної структури білка.(C) Взаємодія міжмолекулярної білкової білок водневої зв'язку з різних імітованих комплексів, враховуючи специфічні взаємодії тривалості ≥ 10 нс.Відстань донора-акцептора H-зв’язку було встановлено на 3,5 Å, а кут відсічення донора-Н-акцептора встановлювали на ≥ 160 ° –180 °.(D) мічені залишки, що утворюють взаємодію білка-білка HLA-A з відповідними партнерами, охоплюючи ≥ 20 нс, витягнуті з фіктивних комплексів HLA-A-H2B та HLA-A-HMGA1.Білкові структури являють собою середню структуру 100 нс.(E) Взаємодія між комплексами HLA-A-H2B та HLA-A-HMGA1 порівняно з взаємодією, відстеженими моделюванням H2B-HLA понад 100 нс на основі місця взаємодії K або S між двома пептидами.Комплекси /HMGA1-HLA-A /H2B-HLA-A-HMGA1.Порогове значення для оцінки поперечних зв’язків було встановлено на 3,0, і були враховані конкретні взаємодії від МД ≥ 10 нс.Білкові структури візуалізували за допомогою студії Biovia Discovery (Dassault Systèmes, Biovia Corp., Сан -Дієго, Каліфорнія, США) та молекулярного робочого середовища (MOE; Chemical Computing Group Inc., Монреаль, Квебек, Канада).
Стабільність молекул HLA-A з часом (стандартне відхилення; RMSD або стандартне відхилення; RMSF) показала, що наявність білків H2B або HMGA1 у комплексах, стабілізованих HLA-A (мал. 8б, рис. S5).Білок HMGA1 щільно зв'язується з B2M-сайтом HLA-A, індукуючи стабільність амінокислот HLA-A у комплексі HLA-A-HMGA1 або H2B-HLA-A-HMGA1 (мал. 8б, рис. S5).Зокрема, залишки HLA ~ 60-90 та ~ 180-210 виявились менш гнучкими в присутності H2B (рис. 8В).H2B та HMGA1 показали краще зв'язування з HLA-A у комплексі H2B-HLA-A-HMGA1 порівняно з зв'язуванням HLA-A лише з H2B або HMGA1 (мал. 8С, D; Таблиця S5).Залишки, що беруть участь у водневому зв’язку (MD, моделюючи високу зайнятість ≥ 10 нс), збігаються з ділянками взаємодії CLMS (K або S залишками) у комплексі, що дозволяє припустити, що взаємодія, ідентифіковані CLMS, є дуже надійними.У моделюванні CLMS та MD залишки HLA-A між 190-210 та приблизно 200-220 амінокислотами були зв'язують H2B та HMGA1 відповідно (рис. 8е).
Взаємодії білок-білка утворюють динамічні структурні мережі, які опосередковують внутрішньоклітинне спілкування у відповідь на певні подразники.Оскільки багато підходів про протеоміки виявляють зміни загального стабільного рівня білка, динаміка взаємодії білка-білка потребує додаткових інструментів для захоплення зв'язувальних інтерфейсів, а CLM є одним із таких інструментів.Система сигналізації інтерферону-це цитокінська мережа, яка дозволяє клітинам реагувати на цілий ряд патогенних та внутрішніх патологічних сигналів, що завершується індукцією підмножин білків, що індукують інтерфероном.Ми застосували CLM, щоб визначити, чи можна було б ідентифікувати нові взаємодії з білко-білком серед панелі білків, спричинених інтерфероном.Глобальний аналіз зшивання білка в клітинній моделі FLO-1, що реагує інтерферон, використовувався для захоплення білкових комплексів.Екстракція триптичних пептидів з нехресних та зшитого клітин дозволяє підрахувати пептиди, збагачення шляхів та розподіл довжини пептиду з визначеною інтенсивністю LFQ.Канонічні інтерферону, індуковані білками, були ідентифіковані як позитивний внутрішній контроль, тоді як нові міжмолекулярні та внутрішньомолекулярні зшиті аддукти канонічних інтерферону, індукованих білками, такі як MX1, UP18, OAS3 та STAT1.Досліджено різні структурні особливості та взаємодії у функціональних областях.
Взаємодія між HLA-A, MDN1 та H2B була виявлена ​​шляхом імуноблоттінгу в клітинах FLO-1 та A549, оброблених та не лікуваним IFNα.Наші результати підкреслюють, що комплекси HLA-A з H2B залежно від IFNα.Наша робота являє собою цікавий шлях для подальшого вивчення спільної локалізації цих двох комплексів.Також було б цікаво розширити підхід CLMS до панелі клітинних ліній для виявлення незалежних від інтерферону-опосередкованих інтерферону.Нарешті, ми використовували моделювання MD як альтернативний підхід для розуміння конформаційної динаміки білків, що беруть участь у комплексі H2BFS-HLA-A-HMGA1, який відстежував внутрішньомолекулярні та міжмолекулярні перехресні розмови.Висновки з даних CLMS говорять про можливість різних конформацій білків H2BFS, HLA-A та HMGA1.Можливі різні конформації між цими док -док -білками виявили кілька взаємодій, подібних до тих, що спостерігаються в наборі даних CLMS.Однією з головних сил нашого методу є те, що він дозволяє легко ідентифікувати взаємодіючі високополіморфні гени, такі як HLA, тому буде цікаво вивчити взаємодію білків, специфічних для HLA Haplotype, які в іншому випадку важко вивчити.У сукупності наші дані демонструють, що CLM можуть бути використані для розширення нашого розуміння сигнальних мереж, спричинених інтерфероном, та створення основи для вивчення більш складних міжклітинних систем у мікросередовищі пухлини.
Клітини FLO-1 отримували від ATCC і підтримували в DMEM (GIBCO), доповненому 1% пеніциліном/стрептоміцином (Invitrogen), 10% сироваткою великої рогатої худоби (GIBCO) та зберігали при 37 ° С та 5% CO2.Клітини вирощували до 70-80% злиття перед лікуванням IFNα14 (виготовляли Едінбурзьким виробництвом білка).Усі інші хімічні речовини та реагенти були придбані у Sigma Aldrich, якщо не зазначено інше.
Клітини FLO-1 культивували в 6-лункових планшетах, а наступного дня клітини обробляли 10 нг/мл IFNα14 протягом 24 годин до приблизно 80% злиття.Клітини тричі промивали PBS і лігували свіжоприготовленими DSS (Thermo Fisher Scientific) (розчиняли в ДМСО) у PBS протягом 5 хв при 37 ° С до кінцевої концентрації 0,5 мм.Реакцію зшивання DSS замінювали PBS, а залишкову DSS гасили додаванням 20 мм трис (pH 8,0) у PBS протягом 15 хв при 37 ° С.Клітини збирали шляхом вискоблювання та збирали в трубах з низьким рівнем зв'язування (аксиген).
Клітинний гранул лізирували 300 мкл буфера лізису сечовини (8 м сечовина, 0,1 м трис, рН 8,5) протягом 30 хв при кімнатній температурі з випадковим струшуванням.Усі кроки центрифугування проводили при 14000 XG при 8 ° С.Центрифугуйте лізат протягом 10 хвилин і перенесіть супернатант у нову трубку.Решта прозорих частинок розчиняли в 150 мкл другого буфера лізису (2 м сечовина, 2% (мас./Об.) SDS (додецилсульфат натрію) протягом 30 хвилин і більше, поки не було отримано однорідний водний розчин.Лізат центрифугували протягом 20 хвилин, а супернатант змішували з лізатом, отриманим на попередньому етапі.Концентрації білка оцінювали за допомогою мікро -аналізу Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) відповідно до інструкцій виробника щодо процедур мікропланшетів.Зразки швидко заморожували в рідкому азоті і зберігали при -80 ° С.
69 Коротко, білок зшивають 200 мкл буфера сечовини (8 м сечовина в 0,1 м трис, рН 8,5), вихор і вдвічі.Усі кроки центрифугування проводили при 14 000 XG при 25 ° С.Потім додайте до фільтра другу половину білка і повторіть однакові кроки.Відновлення білка проводили шляхом додавання 100 мкл 17 мМ трис (2-карбоксиетил) фосфіна гідрохлориду (TCEP) у буфері сечовини.Відновлення перемішували на термоміксері при 600 об / хв протягом 30 хв при 37 ° С.Крім того, колонку центрифугували і зменшений зшитий білок алкілували за допомогою 100 мкл 50 мМ йодоацетаміду в буфері сечовини.Реакцію алкілування проводили при кімнатній температурі протягом 20 хвилин у темряві.Обертайте колонку, вимийте стінки колони 3 рази 100 мкл буфера сечовини, а потім центрифугу.Таку ж операцію проводили 3 рази, використовуючи 100 мкл 100 мМ бікарбонату амонію.Перед трипсинізацією замініть колекційну трубку новою.Додайте буфер перетравлення, що містить 50 мМ бікарбонату амонію та трипсин 1 мкл, розведений у буфері трипсину (Promega).Співвідношення трипсину до білка підтримували близько 1:33, а реакції травлення інкубували протягом ночі при 37 ° С у вологому камері.Зшитний пептид елюювали з фільтра центрифугуванням протягом 25 хвилин.Відновлення пептиду покращили додаванням до фільтра 50 мкл 0,5 М NaCl з подальшим центрифугуванням протягом 25 хвилин.
C18 Мікро-спінові колони (Гарвардський апарат) використовувались для дезальту зшитого триптичного пептидів за протоколом, описаним Bouchal et al.70 з незначними модифікаціями.Коротко, спінові колони C18 активовувались трьома промиваннями 0,1% мурашиної кислоти (FA) в ацетонітрилі (ACN) (Merck) та два промивання 0,1% FA.Стовпчик гідратував 0,1% ФА протягом 15 хвилин.Зразки навантаження в спінові колони і 3 рази промивають 0,1% ФА.Здійснені пептиди послідовно елюювали з поетапним градієнтом, використовуючи 50%, 80% та 100% ACN у 0,1% ФА.Зразки сушили в концентраторі SpeedVac Plus (EPPENDORF), поки залишкова рідина не повністю зникла.Елюючі пептиди розчиняли в 100 мкл 0,08% трифторооцтової кислоти в 2,5% ACN, а концентрації вимірювали на Nanodrop 2000 (Thermo Scientific).Приблизно 1 мкг зшитого пептиду на зразок вводили в систему LC-MS/MS.
Зшиті пептиди відокремлювали на кінцевій системі 3000 RSLCNANO LC (Thermo Scientific), підключеному до мас-спектрометра Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Поперечні пептиди збирали на 300 мкм ідентифікатор, 5 мм завдовжки µ-PRE-колони C18 Capture, упакована з сорбентом C18 Pepmap100 та 5 мкМ сорбентом Pepmap (Thermo Scientific).Завантажте потік насоса, встановлений на 5 мкл/хв 0,08% трифтороцтової кислоти, розчиненої в 2,5% ACN.Поперечні пептиди відокремлювали на аналітичному зрощеному колонці кремнезему внутрішнім діаметром 75 мкм і довжиною 150 мм, наповненим 2 мкМ сорбентом Pepmap (Thermo Scientific).Мобільні фази A і B складалися з 0,1% ФА у воді та 0,1% ФА в ацетонітрилі відповідно.Градієнт починається з 2,5% В і лінійно збільшується до 40% B протягом 90 хвилин, потім до 90% B протягом наступних 2 хвилин.Склад мобільної фази підтримували на рівні 90% B протягом 10 хвилин, а потім лінійно зменшувались до 2,5% B протягом 2 хвилин.Стовпчик врівноважували на 2,5% B протягом 8 хвилин до наступного циклу.Зшиті пептиди, елюйовані з аналітичної колони, були іонізовані в джерелі іонізації наноелектропресії (NSI) та вводили в мас-спектрометр Exploris 480 (Thermo Scientific).
Мас -спектрометр Orbitrap Exploris 480 працював у режимі кореляції позитивних даних.Повне сканування було проведено в режимі секції при роздільній здатності 120 000 з налаштуваннями діапазону від M/z 350 до M/Z 2000 -го.Нормалізовану ціль AGC встановлювали на 300% з максимальним часом введення 50 мс.Для пептидів було встановлено моноізотопічне пікове виявлення.Параметр релаксації обмеження встановлений на істинне, якщо знайдено занадто мало попередників.Мінімальна іонна сила попередника була встановлена ​​на 5,0E3, а в експериментах було включено стани попередника до +8.
Час циклу між основними скануваннями в режимі кореляції даних був встановлений на 2,5 секунди.Виключення динамічної маси було встановлено на 20 с після першої фрагментації іона -попередника.Вікно ізоляції попередника було встановлено 2 -й.Тип нормалізованої енергії зіткнення з фіксованим енергетичним режимом зіткнення був обраний у скануванні MS/MS, що залежить від даних.Енергія зіткнення встановлена ​​на 30%.Роздільна здатність Orbitrap була встановлена ​​на 15000, а ціль АГК - 100%.Спеціальний максимальний час впорскування встановлюється на 60 мілісекунд.
Перш ніж відстежувати білко-білкову мережу у зшиті зразки, ми обробляли необроблені файли за допомогою пакету MaxQuant (версія 1.6.12.0) 26,27 для виявлення простежуваних пептидів/білків у зразках.Крім того, аналогічні протеомічні аналізи проводили на неперевершених зразках FLO-1, які отримували та не обробляли IFNα.Дані MS/MS шукали в базі даних Uniprot Human (www.uniprot.org) (завантажено 12 серпня 2020 року, містить 75 093 записів) за допомогою вбудованої пошукової системи Andromeda27.Пошук проводився без вказівки на специфічність ферменту та різні модифікації дезаміда (n, q) та окислення (m).Масові допуски попередника встановлювали на рівні 20 проміле, а іони продукту - 0,02 DA.Початкове та максимальне відхилення маси було встановлено на 10 проміле.Максимальну масу пептиду встановлювали на 4600 да, а подібність послідовності була встановлена ​​між 7 і 25 амінокислотами (АА).Подальший статистичний аналіз проводили за допомогою програми Perseus (версія 1.6.10.45).Вміст білка обчислювали шляхом нормалізації спектральної інтенсивності білка (інтенсивність LFQ; не марковане кількісне визначення) 27, а значення інтенсивності перетворювались у LOG2.Ієрархічна кластеризація білків, ідентифікованих їх інтенсивністю пептиду, була побудована за допомогою пакету PheatMap (v1.0.12) у R (v 4.1.2).Аналіз збагачення шляхів проводили за допомогою бази даних про реакцію для білків, оброблених IFNα, які були більше ніж у чотири рази, порівняно з необробленими зразками.
Ідентифікацію лізину (K) або серину (S) специфічних хімічних зшивання білкових комплексів, контрольованих LC-MS/MS, проводили за допомогою спектроскопічної ідентифікаційної машини (SIM-XL) для зшитого пептидів (SIM-XL) 29.По-перше, можливі взаємодії між інтерфероном, пов'язаними з інтерфероном (IFN) підписанням резистентності до пошкодження ДНК (IRDS), досліджували за допомогою набору даних білка IRDS, описаним у Padariya et al.28.Обстеження всіх умов та повторів усього людського Uniprot є обчислювально інтенсивним, тому вся людська база даних Uniprot (www.uniprot.org) (завантажена 12 серпня 2020 року, містить 75 093 записів) проти повторених IFNα.Ці отримані взаємодії з високою знаком були розширені та перевірені у всіх повторах та умовах.
У SIM-XL DSS використовували для зсуву (XL), а зсув ваги XL та зсув ваги модифікації були встановлені відповідно до 138,06 та 156,07.Вважаються такі сайти реакцій на зшивання: KK, KS та KN-TREM, без репортерних іонів.І PPM -попередник, і фрагмент були встановлені на 20, а поріг XREA був встановлений на 0,15.Трипсин вважався абсолютно специфічним, і був реалізований метод фрагментації високої енергії (HCD).Поріг відновлення динамічного БД Xcorr та мінімальна кількість пептидів для динамічного зменшення БД були встановлені відповідно на 2,5 та 2.Інші параметри: Моноізотопна ймовірність та відсічення збігу на піку, мінімум 4 залишки АА на ланцюг та максимальний заряд ланцюга та 3 максимуми пропущених розколів.Отримані зшиті 2D-карти аналізували (SIM-XL), а графічне зображення XQuest28 використовувалося для побудови 2D-карт.Попередження білків на білкових структурах наведені в Pymol (Pymol Molecular Graphics System, версія 2.0 Schrödinger, LLC).
Структури білкової моделі були створені за допомогою сервера Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11, використовуючи принципи моделювання гомології та впровадження "прихованого методу Маркова".Phyre2 генерує модельні структури на основі вирівнювання послідовностей із відомими білковими структурами.Для H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 та MDN1 Білки, шаблонні структури 1KX552, 1KJ349, 2eze55, 6Hlu62 та 6i2665.Крім того, також розглядалася структура Alphafold71 MX1, UBP18 та ROBO1.Структуру білка візуалізували за допомогою пакету Visualizer Studio Biovia Discovery (Dassault Systèmes, Biovia, San Diego, Каліфорнія, США) та пакет молекулярного робочого середовища (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Канада).