347 12,7*1,24 мм спіральна труба з нержавіючої сталі, молекулярний механізм синхронної електростатичної конденсації та коагрегації α-синуклеїну та тау

Дякуємо, що відвідали Nature.com.Ви використовуєте версію браузера з обмеженою підтримкою CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Крім того, щоб забезпечити постійну підтримку, ми показуємо сайт без стилів і JavaScript.
Повзунки, що показують три статті на слайді.Використовуйте кнопки «Назад» і «Далі» для переходу між слайдами або кнопки керування слайдами в кінці для переходу між слайдами.

Специфікація труб з нержавіючої сталі 347

347 12,7*1,24 мм спіральна труба з нержавіючої сталі

Зовнішній діаметр: 6,00 мм OD до 914,4 мм OD, розміри до 24” NB доступні на складі, зовнішній розмір сталевих труб доступні на складі

SS 347 Діапазон товщини труб: 0,3 мм – 50 мм, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S тощо (0,5-12 мм) Або нестандартний розмір, який буде підігнаний за потреби

Тип: безшовні труби SS 347 |Труби SS 347 ERW |SS 347 зварні труби |SS 347 Фабричні труби |Труби SS 347 CDW, труби LSAW / шовні зварні / перемальовані

Форма: круглі труби/труби SS 347, квадратні труби/труби SS 347, прямокутні труби/труби SS 347, згорнуті труби SS 347, U-подібна форма SS 347, рулони SS 347, гідравлічні труби SS 347

Довжина: одинарна довільна, подвійна довільна та необхідна довжина Кінець: рівний кінець, скошений кінець, з протектором

Кінцевий захист: пластикові кришки |Зовнішнє покриття: 2B, № 4, № 1, № 8 дзеркальне покриття для труб з нержавіючої сталі, покриття згідно з вимогами замовника

Умови доставки: відпалені та мариновані, поліровані, яскраво відпалені, холодне витягування

Перевірка, звіти про випробування: Сертифікати випробувань млинів, EN 10204 3.1, звіти про хімічні речовини, звіти про механічні властивості, звіти про випробування PMI, звіти про візуальні перевірки, звіти сторонніх перевірок, звіти лабораторій, затверджених NABL, звіт про руйнівні випробування, звіти про неруйнівні випробування

Упаковка: упакована в дерев'яні ящики, поліетиленові пакети, сталеві стрічки в комплекті або відповідно до запитів клієнтів

Спеціальні пропозиції: інші розміри та специфікації, ніж вище, можуть бути виготовлені за запитом

SS 347 Діапазон розмірів труб: 1/2 дюйма NB, зовнішній діаметр до 24 дюймів

ASTM A312 347: Безшовна та прямошовна зварна аустенітна труба, призначена для високотемпературної та загальної корозійної роботи.Під час зварювання не допускається використання присадного металу.

ASTM A358 347: аустенітна труба, зварена плавленням, для корозійних та/або високих температур.Зазвичай за цією специфікацією виготовляють лише труби діаметром до 8 дюймів.Під час зварювання допускається додавання присадного металу.

ASTM A790 347: Безшовна та прямошовна зварна феритно-аустенітна (дуплексна) труба, призначена для загальної корозійної роботи, з особливим акцентом на стійкість до корозійного розтріскування під напругою.

ASTM A409 347: прямошовна або спіральношовна електрозварна аустенітна легкостінна труба великого діаметру розміром від 14 до 30 дюймів зі стінками Sch5S і Sch 10S для корозійних та/або високих

ASTM A376 347: Безшовна аустенітна труба для високотемпературного застосування.

ASTM A813 347: одношовна, одно- або подвійно зварена аустенітна труба для високотемпературних і корозійних застосувань.

ASTM A814 347: Холоднооброблена зварна аустенітна труба для високотемпературної та загальної корозійної роботи.

Хімічний склад труб з нержавіючої сталі 347H

Механічні властивості труби з нержавіючої сталі 347H

Фізичні властивості труб з нержавіючої сталі 347H

Еквівалентні марки для труб з нержавіючої сталі 347H

Агрегація амілоїдного альфа-синуклеїну (αS) є ознакою хвороби Паркінсона та інших синуклеїнопатій.Нещодавно білок тау, який зазвичай асоціюється з хворобою Альцгеймера, був пов’язаний з патологією αS і виявлено, що він спільно локалізується в багатих на αS включеннях, хоча молекулярний механізм коагрегації двох білків залишається неясним.Тут ми повідомляємо, що фаза αS розділяється на рідкі конденсати за допомогою електростатичної комплексної конденсації з позитивно зарядженими поліпептидами, такими як тау.Залежно від спорідненості αS до полікатіонів і швидкості виснаження валентності коагуляційної мережі згустки піддаються швидкому гелеутворенню або коалесценції з подальшою повільною агрегацією амілоїду.Об’єднавши набір передових біофізичних методів, ми змогли охарактеризувати поділ фази рідина-рідина αS/Tau та визначити ключові фактори, які призводять до утворення гетерогенних агрегатів, що містять обидва білки, у рідкому білковому конденсаті.
На додаток до мембранних компартментів, просторове розділення в клітинах також може бути досягнуто шляхом утворення насичених білком, схожих на рідину щільних тіл, які називаються біомолекулярними конденсатами або краплями, за допомогою процесу, відомого як розділення фази рідина-рідина (LLPS).Ці краплі утворюються в результаті мультивалентних часових взаємодій, зазвичай між білками або білками та РНК, і виконують різноманітні функції майже в усіх живих системах.Велика кількість LLP-здатних білків демонструє послідовності низької складності, які є сильно невпорядкованими за своєю природою та утворенням біомолекулярних конденсатів3,4,5.Численні експериментальні дослідження виявили гнучку, часто невпорядковану та багатовалентну природу білків, які утворюють ці рідкоподібні конденсати, хоча мало відомо про конкретні молекулярні детермінанти, які контролюють ріст і дозрівання цих конденсатів до твердоподібних. стан..
Нові дані підтверджують гіпотезу про те, що аномальний білковий LLPS і трансформація крапель у тверді структури можуть бути відповідними клітинними шляхами, що призводять до утворення нерозчинних токсичних агрегатів, які часто є ознаками дегенеративних захворювань.Багато LLPS-асоційованих внутрішньо невпорядкованих білків (IDP), часто високо заряджених і гнучких, давно асоціювалися з нейродегенерацією через процес агрегації амілоїду.Зокрема, було показано, що біомолекулярні конденсати IDP, такі як FUS7 або TDP-438, або білки з великими доменами низької складності, такі як hnRNPA19, старіють у гелеподібні або навіть тверді форми за допомогою процесу, який називається псевдозрідженням.з'єднання.до твердофазового переходу (LSPT) як функції часу або у відповідь на певні посттрансляційні модифікації чи патологічно значущі мутації1,7.
Іншим IDP, пов’язаним з LLPS in vivo, є Тау, асоційований з мікротрубочками невпорядкований білок, агрегація амілоїду якого пов’язана з хворобою Альцгеймера10, але нещодавно також була залучена до хвороби Паркінсона (PD) та інших синаптичних ядерних протеїнопатій 11, 12, 13.Було показано, що тау спонтанно дисоціює з розчину/цитоплазми через сприятливі електростатичні взаємодії14, що призводить до утворення крапель, збагачених тау, відомих як електростатичні коацервати.Було також помічено, що цей тип неспецифічної взаємодії є рушійною силою багатьох біомолекулярних конденсатів у природі15.У випадку тау-білка електростатична агрегація може утворюватися шляхом простої агрегації, при якій протилежно заряджені ділянки білка запускають процес розщеплення, або шляхом складної агрегації через взаємодію з негативно зарядженими полімерами, такими як РНК.
Нещодавно α-синуклеїн (αS), амілоїдний IDP, який бере участь у розвитку хвороби Паркінсона та інших нейродегенеративних захворювань, спільно відомих як синуклеїнопатія 17, 18, був продемонстрований на клітинних і тваринних моделях 19, 20, зосереджених у білкових конденсатах з рідиноподібною поведінкою.Дослідження in vitro показали, що αS піддається LLPS шляхом простої агрегації через переважно гідрофобні взаємодії, хоча цей процес вимагає виключно високих концентрацій білка та нетипово тривалого часу інкубації19,21.Чи утворюються αS-вмісні конденсати, спостережувані in vivo, цим чи іншим процесом LLPS, залишається ключовим невирішеним питанням.Подібним чином, хоча агрегація амілоїду αS спостерігалася в нейронах при БП та інших синуклеїнопатіях, точний механізм, за допомогою якого αS піддається внутрішньоклітинній агрегації амілоїду, залишається неясним, оскільки надмірна експресія цього білка, очевидно, не запускає цей процес сама по собі.Часто потрібне додаткове клітинне пошкодження, що свідчить про те, що для ренуклеації внутрішньоклітинних амілоїдних комплексів αS необхідні певні клітинні місця або мікрооточення.Одним із клітинних середовищ, яке особливо схильне до агрегації, може бути внутрішня частина білкових конденсатів 23 .
Цікаво, що було виявлено, що αS і тау спільно локалізуються в характерних хворобливих включеннях у людей із хворобою Паркінсона та іншими синуклеїнопатіями 24,25, а експерименти показали синергічний патологічний зв’язок між двома білками 26,27, що свідчить про потенційний зв’язок між агрегацією αS та тау при нейродегенеративних захворюваннях.захворювання.Було виявлено, що αS і тау взаємодіють і сприяють агрегації один одного in vitro та in vivo 28, 29, а гетерогенні агрегати, що складаються з цих двох білків, спостерігаються в мозку пацієнтів із синуклеїнопатіями 30 .Однак мало відомо про молекулярну основу взаємодії між αS і тау та механізм його коагрегації.Повідомлялося, що αS взаємодіє з тау через електростатичне притягання між сильно негативно зарядженою С-кінцевою областю αS і центральною областю, багатою проліном тау, яка також збагачена позитивно зарядженими залишками.
У цьому дослідженні ми показуємо, що αS дійсно може дисоціювати на краплі за допомогою конденсації електростатичного комплексу в присутності білка тау, на відміну від його взаємодії з іншими позитивно зарядженими поліпептидами, такими як полі-L-лізин (pLK), і в цьому процесі .αS діє як каркасна молекула для мережі крапель.Виявлено помітні відмінності в процесі дозрівання електростатичних αS-коацерватів, які пов’язані з відмінностями у валентності та силі взаємодії білків, залучених до коацерватної мережі.Цікаво, що ми спостерігали коагрегацію амілоїдних білків αS і тау в довгоіснуючих рідких коацерватах і визначили деякі ключові фактори, які призводять до коагрегації цих двох білків у таких коацерватах.Тут ми детально описуємо цей процес, який є можливим молекулярним механізмом, що лежить в основі спільної локалізації двох білків у специфічних для захворювання включеннях.
αS має високоаніонний С-кінцевий хвіст при нейтральному рН (рис. 1а), і ми припустили, що він може піддаватися LLPS через конденсацію електростатичних комплексів з полікатіонними невпорядкованими поліпептидними молекулами.Ми використовували 100-залишок полі-L-лізину (pLK) як вихідну модельну молекулу через його позитивно заряджену та невпорядковану полімерну природу при нейтральному рН 32. По-перше, ми підтвердили, що pLK взаємодіє з доменом Ct αS за допомогою ЯМР-спектроскопії розчину. (Малюнок 1b) з використанням 13C/15N-міченого αS у присутності зростаючих молярних співвідношень αS:pLK.Взаємодія pLK з Ct-доменом αS проявляється у збуреннях хімічного зсуву та зменшенні інтенсивності піку в цій ділянці білка.Цікаво, що коли ми змішували αS з pLK при концентрації αS приблизно.5–25 мкМ у присутності поліетиленгліколю (5–15% ПЕГ-8) (типовий буфер LLPS: 10 мМ HEPES рН 7,4, 100 мМ NaCl, 15% ПЕГ-8) ми негайно пройшли через широке поле утворення білка .краплі спостерігали за допомогою флуоресцентної (WF) і світлопольної (BF) мікроскопії (рис. 1c).Краплі розміром 1-5 мкм, що містять концентрований αS (доданий 1 мкМ αS, позначений AlexaFluor488, AF488-αS), їхні електростатичні властивості можна отримати з їх стійкості до 10% 1,6-гександиолу (1,6-HD) і його чутливості до збільшення концентрації NaCl (рис. 1в).Рідиноподібна природа коацерватів електростатичного комплексу αS/pLK демонструється їх здатністю зливатися протягом мілісекунд (рис. 1d).Використовуючи турбідиметрію, ми кількісно оцінили утворення крапель за цих умов, підтвердили електростатичну природу основної взаємодії, пов’язаної з її стабільністю (рис. 1e), і оцінили вплив різних співвідношень полімерів на процес LLPS (рис. 1f).Хоча утворення крапель спостерігається в широкому діапазоні співвідношень полімерів, процес є дуже сприятливим, коли pLK перевищує αS.LLPs також спостерігалися з використанням хімічно іншого витісняючого агента декстрану-70 (70 кДа) або з використанням різноманітних форматів зразків, включаючи краплі на предметному склі, лунки мікропланшетів з різних матеріалів, Eppendorf або кварцові капіляри.
Схематичне зображення різних білкових областей у варіантах WT-αS і ΔCt-αS, використаних у цьому дослідженні.Амфіпатичний N-кінцевий домен, гідрофобна амілоїдоутворююча область (NAC) і негативно заряджений С-кінцевий домен показані синім, оранжевим і червоним відповідно.Показано чисту плату за залишковий (NCPR) карту WT-αS.b ЯМР аналіз взаємодії αS/pLK за відсутності макромолекулярних згустків.У міру збільшення концентрації pLK (молярні співвідношення αS:pLK 1:0,5, 1:1,5 і 1:10 показано світло-зеленим, зеленим і темно-зеленим відповідно).c Коацерват αS/pLK (молярне співвідношення 1:10) при 25 мкМ (1 мкМ αS, мічений AF488 або Atto647N, мічений pLK для візуалізації WF) у буфері LLPS (верхній) або з додаванням 500 мМ NaCl (нижній ліворуч) або через 10 % 1,6-гександиолу (1,6-HD; внизу праворуч).Масштабна шкала = 20 мкм.d Репрезентативні мікроскопічні зображення злиття крапель BF αS/pLK (молярне співвідношення 1:10) у концентрації 25 мкМ;стрілки вказують на злиття окремих крапель (червона та жовта стрілки) в нову краплю (помаранчева стрілка) протягом 200 мс).Масштабна шкала = 20 мкм.e Розсіювання світла (при 350 нм) Агрегація αS/pLK у буфері LLPS до та після додавання 500 мМ NaCl або 10% 1,6-HD при 25 мкМ αS (N = 3 повтори зразків, також вказано середнє значення та стандартне відхилення).f Зображення BF (угорі) та аналіз розсіювання світла (при 350 нм, унизу) агрегації αS/pLK при 25 мкМ αS зі збільшенням молярного співвідношення αS:pLK (N = 3 екземпляри зразків, середнє значення та стандартне відхилення також вказані).Масштабна шкала = 10 мкм.Масштабна шкала на одному зображенні вказує масштаб усіх зображень на одній панелі.Необроблені дані надаються у формі файлів необроблених даних.
На основі наших спостережень за конденсацією електростатичного комплексу αS/pLK і попередніх спостережень αS як клієнтської молекули конденсату тау/РНК через пряму взаємодію з tau31, ми припустили, що αS і тау можуть спільно розділятися з розчинником за відсутності РНК. конденсація.через електростатичні комплекси, а αS є каркасним білком у коацерватах αS/Tau (див. розподіл заряду тау на малюнку 2e).Ми спостерігали, що коли 10 мкМ αS і 10 мкМ Tau441 (містять 1 мкМ AF488-αS і 1 мкМ Atto647N-Tau відповідно) змішують разом у буфері LLPS, вони легко утворюють білкові агрегати, що містять обидва білки, як видно за допомогою WF мікроскопії.(Рис. 2а).Колокалізація двох білків у краплях була підтверджена конфокальною (CF) мікроскопією (додаткова рис. 1a).Подібна поведінка спостерігалася, коли декстран-70 використовувався як агент агрегації (додатковий рис. 1c).Використовуючи або FITC-мічений ПЕГ, або декстран, ми виявили, що обидва агенти скупчення були рівномірно розподілені по зразках, не демонструючи ані сегрегації, ані асоціації (додатковий рис. 1d).Швидше це свідчить про те, що в цій системі вони сприяють розділенню фаз через ефекти макромолекулярного скупчення, оскільки PEG є переважно стабільним агентом скупчення, як це видно в інших системах LLP33,34.Ці багаті білком краплі були чутливі до NaCl (1 М), але не до 1,6-HD (10% об./об.), підтверджуючи їх електростатичні властивості (додаткова рис. 2a, b).Їх поведінка рідини була підтверджена спостереженням мілісекундних подій злиття крапель за допомогою BF мікроскопії (рис. 2b).
a Конфокальні (CF) мікроскопічні зображення коацерватів αS/Tau441 у буфері LLPS (10 мкМ кожного білка, 0,5 мкМ міченого AF488 αS і Tau441, міченого Atto647N).b Репрезентативні зображення диференційного інтерференційного контрасту (DIC) подій злиття крапель αS/Tau441 (10 мкМ для кожного білка).c Фазова діаграма на основі розсіювання світла (при 350 нм) Tau441 LLPS (0–15 мкМ) за відсутності (ліворуч) або присутності (праворуч) 50 мкМ αS.Більш теплі кольори вказують на більше розсіювання.d Розсіювання світла зразків αS/Tau441 LLPS зі збільшенням концентрації αS (Tau441 при 5 мкМ, N = 2–3 повторення зразка, як зазначено).e Схематичне зображення деяких варіантів білка тау та різних ділянок білка, що використовуються в цьому дослідженні: негативно заряджений N-кінцевий домен (червоний), збагачений проліном регіон (синій), домен зв’язування мікротрубочок (MTBD, виділено оранжевим) і парна спіраль, що утворює амілоїд.філаментні області (PHF), розташовані в межах MTBD (сірі).Показано чисту плату за залишок (NCPR) для Tau441.f Використовуючи 1 мкМ AF488-міченого αS і Atto647N-міченого ΔNt-, використовуючи 1 мкМ AF488-міченого αS або ΔCt-αS у присутності ΔNt-Tau (верхній, 10 мкМ на білок) або K18 (нижній, 50 мкМ на білок) ) ) ) мікрофотографії WF, конденсованих у буфері LLPS або K18.Масштабні смужки на одному зображенні представляють масштаб усіх зображень на одній панелі (20 мкм для панелей a, b і f).Необроблені дані для панелей c і d надаються як файли необроблених даних.
Щоб перевірити роль αS у цьому процесі LLPS, ми спочатку дослідили вплив αS на стабільність крапель за допомогою нефелометрії з використанням зростаючих концентрацій NaCl (рис. 2c).Чим вище концентрація солі в зразках, що містять αS, тим вище значення світлорозсіювання (при 350 нм), що вказує на стабілізуючу роль αS в цій системі LLPS.Подібний ефект можна спостерігати при збільшенні концентрації αS (і, отже, співвідношення αS:Tau441) до приблизно.10-кратне збільшення відносно концентрації тау (5 мкМ) (рис. 2d).Щоб продемонструвати, що αS є каркасним білком у коацерватах, ми вирішили дослідити поведінку порушеного LLPS мутанта Tau, у якого відсутня негативно заряджена N-кінцева область (залишки 1–150, див. рис. 2e), яка називається ΔNt-Tau.WF-мікроскопія та нефелометрія підтвердили, що сам ΔNt-Tau не піддавався LLPS (рис. 2f і додатковий рис. 2d), як повідомлялося раніше 14. Однак, коли αS додавали до дисперсійних розчинів цього усіченого варіанту Tau, процес LLPS був повністю відновлено з щільністю крапель, близькою до щільності крапель повнорозмірних розчинів Tau і αS за аналогічних умов і концентрацій білка.Цей процес також можна спостерігати в умовах низького макромолекулярного скупчення (додатковий рис. 2c).Роль C-кінцевої ділянки αS, але не всієї її довжини, у процесі LLPS була продемонстрована інгібуванням утворення крапель за допомогою C-кінцевого усіченого варіанту αS, у якого відсутні залишки 104–140 (рис. 1a) (ΔCt- αS) білок (рис. 2f і додатковий рис. 2d).Колокалізація αS і ΔNt-Tau була підтверджена конфокальною флуоресцентною мікроскопією (додаткова рис. 1b).
Для подальшого тестування механізму LLPS між Tau441 і αS було використано додатковий варіант Tau, а саме фрагмент ядра спарених спіральних ниток (PHF) у домені зв’язування мікротрубочок (MTBD), який, якщо він містить чотири характерні повторювані домени, широко відомі як фрагмент К18 (див. рис. 2д).Нещодавно повідомлялося, що αS переважно зв'язується з тау-білком, розташованим у домені, багатому на пролін, у послідовності, яка передує домену, що зв'язує мікротрубочки.Однак область PHF також багата позитивно зарядженими залишками (див. Малюнок 2e), особливо лізином (15% залишків), що спонукало нас перевірити, чи ця область також сприяє конденсації комплексу αS/Tau.Ми спостерігали, що K18 сам по собі не може викликати LLPS у концентраціях до 100 мкМ за перевірених умов (буфер LLPS з 15% PEG або 20% декстрану) (рис. 2f).Однак, коли ми додавали 50 мкМ αS до 50 мкМ K18, за допомогою нефелометрії (додатковий рис. 2d) і мікроскопії WF (рис. 2f) спостерігалося швидке утворення білкових крапель, що містять K18 і αS.Як і очікувалося, ΔCt-αS не зміг відновити поведінку LLPS K18 (рис. 2f).Ми зауважимо, що агрегація αS/K18 вимагає дещо вищих концентрацій білка, щоб індукувати LLPS порівняно з αS/ΔNt-Tau або αS/Tau441, за інших рівних умов.Це узгоджується з сильнішою взаємодією С-кінцевої області αS з тау-доменом, багатим на пролін, порівняно з доменом, що зв’язує мікротрубочки, як описано раніше 31 .
Враховуючи, що ΔNt-Tau не може виконувати LLPS за відсутності αS, ми вибрали цей варіант Tau як модель для характеристики αS/Tau LLPS, враховуючи його простоту в системах LLPS із повнорозмірним Tau (ізотип, Tau441/Tau441).зі складними (гетеротипними, αS/Tau441) процесами агрегації.Ми порівняли ступінь агрегації αS (як частини білка конденсованої фази, fαS,c) у системах αS/Tau і αS/ΔNt-Tau за допомогою центрифугування та аналізу SDS-PAGE (див. 2e), виявили дуже схожі значення для всіх білків в однаковій концентрації.Зокрема, ми отримали fαS,c 84 ± 2% і 79 ± 7% для αS/Tau і αS/ΔNt-Tau відповідно, що свідчить про те, що гетеротипова взаємодія між αS і tau перевершує взаємодію між молекулами тау.між.
Взаємодія з різними полікатіонами та вплив процесу конденсації на кінетику αS вперше були досліджені методом відновлення флуоресценції після фотовідбілювання (FRAP).Ми протестували коацервати αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau і αS/pLK (100 мкМ αS з додаванням 2 мкМ αS AF488-αS і 100 мкМ Tau441 або ΔNt-Tau або 1 мМ pLK).Дані були отримані протягом перших 30 хвилин після змішування компонентів зразка.З репрезентативних зображень FRAP (рис. 3a, конденсація αS/Tau441) та їхніх відповідних кривих у часі (рис. 3b, додаткова рис. 3) можна побачити, що кінетика αS дуже подібна до кінетики коацерватів Tau441.і ΔNt-Tau, що набагато швидше з pLK.Розраховані коефіцієнти дифузії для αS всередині коацервату відповідно до FRAP (як описано Kang et al. 35) становлять D = 0,013 ± 0,009 мкм2/с і D = 0,026 ± 0,008 мкм2/с для αS/Tau441 і αS/ΔNt- для система αS/.pLK, Tau і D = 0,18 ± 0,04 мкм2/с відповідно (рис. 3в).Однак коефіцієнт дифузії αS у дисперсійній фазі на кілька порядків вище, ніж у всіх конденсованих фазах, як визначено методом флуоресцентної кореляційної спектроскопії (FCS, див. Додатковий рис. 3) за тих самих умов (буфер LLPS), але за відсутності полікатіонів. (D = 8 ± 4 мкм2/с).Таким чином, кінетика трансляції αS значно знижена в коацерватах порівняно з білками в дисперсійній фазі через виражені ефекти молекулярного скупчення, хоча всі коацервати зберігають рідиноподібні властивості протягом перших півгодини після їх утворення, на відміну від тау-фази.швидша кінетика в конденсаті pLK.
a–c FRAP аналіз динаміки αS (2% αS, міченого AF488) в електростатичних коацерватах.Репрезентативні зображення аналізів αS/Tau441 FRAP у трьох примірниках показані на (a), де червоні кружечки вказують на знебарвлені ділянки.Масштабна шкала становить 5 мкм.b Середні криві FRAP та (c) розраховані коефіцієнти дифузії (D) для 5–6 (N) різних крапель із трьох експериментів із використанням 100 мкМ αS та еквімолярних концентрацій Tau441 (червоний) або ΔNt-Tau (синій) або pLK (зелений) у десятикратній концентрації LLPS.Стандартне відхилення кривої FRAP показано заштрихованим кольором.Для порівняння, коефіцієнт дифузії αS у дисперсійній фазі визначали в трьох повторах за допомогою флуоресцентної кореляційної спектроскопії (FCS) (див. Додатковий малюнок 3 і методи для отримання додаткової інформації).d Безперервні спектри ЕПР Х-діапазону 100 мкМ TEMPOL-122-αS в буфері LLPS без полікатіону (чорний) або в присутності 100 мкМ Tau441 (червоний) або ΔNt-Tau (синій) або 1 мМ pLK (зелений).На вставці показано збільшене зображення сильних ліній поля, де відбуваються найбільш драматичні зміни.e Криві зв’язування 50 мкМ TEMPOL-122-αS з різними полікатіонами за відсутності LLPS (без PEG).Показано, що знижена амплітуда смуги III порівняно зі смугою II (IIII/III) нормалізованого спектру ЕПР збільшує молярні співвідношення Tau441 (червоний), ΔNt-Tau (синій) і pLK (зелений).Кольорові лінії показують відповідність даним за допомогою моделі грубого зв’язування з n ідентичних і незалежних сайтів зв’язування на кожній кривій.Необроблені дані надаються у формі файлів необроблених даних.
Як доповнення ми досліджували динаміку αS у різних коацерватах за допомогою направленого спінового маркування (SDSL) і безперервного електронного парамагнітного резонансу (CW-EPR).Цей метод виявився дуже корисним для звітування про гнучкість і динаміку IDP з реалістичною залишковою роздільною здатністю36,37,38.З цією метою ми сконструювали залишки цистеїну в одиничних мутантах Cys і використали спіновий зонд 4-гідрокси-2,2,6,6-тетраметилпіперидин-N-оксил (TEMPOL).Похідні малеіміду маркують їх.Більш конкретно, ми вставили зонди TEMPOL у положення 122 або 24 αS (TEMPOL-122-αS і TEMPOL-24-αS).У першому випадку ми націлюємося на С-кінцеву ділянку білка, який бере участь у взаємодії з полікатіонами.Натомість позиція 24 може дати нам інформацію про загальну динаміку білків у конденсаті.В обох випадках сигнали ЕПР, отримані для білків дисперсної фази, відповідали нітроксидним радикалам у швидкорухомому стані.Після поділу фаз у присутності тау або pLK (100 мкМ TEMPOL-αS, Tau441 або ΔNt-Tau у співвідношенні 1:1 або pLK у співвідношенні 1:10) спостерігалося збільшення відносної пікової інтенсивності в спектр ЕПР αS.Лінія втрати розширилася, що вказує на знижену кінетику переорієнтації αS у краплях порівняно з білком у розведеній фазі (рис. 3d, додаткова рис. 4a).Ці зміни більш виражені в положенні 122. У той час як у положенні 24 присутність pLK не впливала на кінетику зонда, у положенні 122 форма спектральної лінії значно змінилася (додатковий рис. 4а).Коли ми спробували змоделювати спектри в положенні 122 двох систем αS/полікатіон, використовуючи ізотропну модель (додатковий малюнок 5а), яка зазвичай використовується для опису динаміки спін-міченого IDP38,39, ми не змогли реконструювати експериментальні спектри..Спектральне моделювання положення 24 обертових контрастів (додатковий рис. 5а).Це свідчить про наявність переважних положень у просторі спінових конфігурацій С-кінцевої області αS у присутності полікатіонів.При розгляді частки αS у конденсованій фазі в умовах експериментального ЕПР (84 ± 2%, 79 ± 7% та 47 ± 4% для αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau та αS/pLK відповідно — див. Додатковий На рис. 2e аналізу даних c) можна побачити, що розширення, виявлене методом ЕПР, головним чином відображає взаємодію С-кінцевої області αS з різними полікатіонами в конденсованій фазі (основна зміна при використанні TEMPOL-122- αS), а не конденсація білка.У зонді спостерігається збільшення мікров'язкості.Як і очікувалося, спектр ЕПР білка в умовах, відмінних від LLPS, був повністю відновлений, коли до суміші додавали 1 М NaCl (додатковий рис. 4b).Загалом наші дані свідчать про те, що зміни, виявлені за допомогою CW-EPR, головним чином відображають взаємодію С-кінцевої області αS з різними полікатіонами в конденсованій фазі, і ця взаємодія виявляється сильнішою з pLK, ніж з Tau.
Щоб отримати більше структурної інформації про білки в коацерваті, ми вирішили вивчити систему LLPS за допомогою ЯМР у розчині.Однак ми змогли виявити лише фракцію αS, що залишилася в дисперсійній фазі, що може бути пов’язано зі зниженою динамікою білка всередині коацервату та щільною фазою на дні розчину в аналізі ЯМР.Коли ми проаналізували структуру та динаміку білка, що залишився в дисперсійній фазі зразка LLPS за допомогою ЯМР (додатковий рис. 5c, d), ми помітили, що білок поводився майже однаково в присутності pLK і ΔNt-Tau, обох з які були у вторинній структурі та динаміці білкового остова, виявлені експериментами з вторинного хімічного зсуву та релаксації R1ρ.Дані ЯМР показують, що C-кінець αS зазнає значної втрати конформаційної гнучкості, зберігаючи свою невпорядковану природу, як і решта білкової послідовності, через його взаємодію з полікатіонами.
Оскільки розширення сигналу CW-EPR, що спостерігається в конденсованій фазі TEMPOL-122-αS, відображає взаємодію білка з полікатіонами, ми провели титрування EPR, щоб оцінити афінність зв’язування αS з різними полікатіонами за відсутності LLPS (немає накопичення Буфер LLPS), що свідчить про те, що взаємодії є однаковими в розведеній і концентрованій фазах (що підтверджується нашими даними, Додатковий рис. 4а та Додатковий рис. 6).Мета полягала в тому, щоб побачити, чи всі коацервати, незважаючи на їхні загальні рідиноподібні властивості, демонструють будь-яку диференціальну поведінку на молекулярному рівні.Як і очікувалося, спектр EPR розширювався зі збільшенням концентрації полікатіону, що відображає зменшення молекулярної гнучкості через молекулярні взаємодії всіх партнерів взаємодії майже до насичення (рис. 3e, додаткова рис. 6).pLK досягав цього насичення при нижчому молярному співвідношенні (полікатіон:αS) порівняно з ΔNt-Tau і Tau441.Насправді порівняння даних із моделлю приблизного зв’язування, припускаючи n ідентичних і незалежних сайтів зв’язування, показало, що уявна константа дисоціації pLK (~5 мкМ) на порядок нижча, ніж константа Tau441 або ΔNt-Tau (~50 мкМ ).мкМ).Хоча це приблизна оцінка, це свідчить про те, що αS має вищу спорідненість до простіших полікатіонів із безперервними областями позитивного заряду.Враховуючи цю різницю в спорідненості між αS і різними полікатіонами, ми припустили, що їхні властивості рідини можуть по-різному змінюватися з часом і, таким чином, страждати від різних процесів LSPT.
Враховуючи дуже скупчене середовище в білковому коацерваті та амілоїдну природу білка, ми спостерігали за поведінкою коацервату з часом, щоб виявити можливі процеси LSPT.Використовуючи BF та CF мікроскопію (рис. 4), ми спостерігали, що αS/Tau441 значною мірою коацервується в розчині, утворюючи великі краплі, які контактують і змочують поверхню на дні лунки/предметного скла як повні краплі, як і очікувалося (додаткова рис. 7d);ми називаємо ці нижні структури «білковими плотами».Ці структури залишалися рідкими, оскільки вони зберігали здатність зливатися (додатковий рис. 7b) і їх можна було побачити протягом кількох годин після запуску LLPS (рис. 4 і додатковий рис. 7c).Ми помітили, що процес змочування є кращим на поверхні гідрофільних, а не гідрофобних матеріалів (додатковий рис. 7а), як і очікувалося для електростатичних коацерватів з незбалансованими зарядами і, отже, високими електростатичними поверхневими потенціалами.Примітно, що коалесценція та сплав αS/ΔNt-Tau були значно зменшені, тоді як конденсати αS/pLK були значно зменшені (рис. 4).Протягом короткого часу інкубації краплі αS/pLK змогли об’єднатися та змочити гідрофільну поверхню, але цей процес швидко припинився, і після 5 годин інкубації спостерігалося лише обмежене злиття та відсутність змочування.– гель-крапельний перехід.
Репрезентативні BF (панелі відтінків сірого) і CF (праві панелі, αS, позначений зеленим кольором AF488) зразків коацервату, що містять 100 мкМ αS (1% флуоресцентної мітки) у буфері LLPS у присутності 100 мкМ Tau441 (верхня) флуоресценція) мікроскопічні зображення ΔNt -Tau (у центрі) або 1 мМ pLK (внизу) при різних часах інкубації та фокусних висотах (z, відстань від дна лунки планшета).Експерименти повторювали 4-6 разів незалежно один від одного з однаковими результатами.Коацервати αS/Tau441 змочуються через 24 години, утворюючи плоти, більші за зображення.Масштабна шкала для всіх зображень становить 20 мкм.
Потім ми запитали, чи призведуть великі рідинноподібні білкові пули, утворені в αS/Tau441 LLPS, до амілоїдної агрегації будь-якого з досліджених білків.Ми спостерігали за дозріванням крапель αS/Tau441 з плином часу за допомогою WF-мікроскопії в тих же умовах, що й вище, але з використанням 1 мкМ AF488-міченого αS і Atto647N-міченого Tau441 (рис. 5a).Як і очікувалося, ми спостерігали повну локалізацію білка протягом усього процесу дозрівання.Цікаво, що з бл.Через 5 годин всередині плотів спостерігалися більш інтенсивні некруглі структури, які ми назвали «точками», деякі з яких були колокалізовані з αS, а деякі були збагачені Tau441 (рис. 5а, білі стрілки).Ці плями завжди спостерігалися на плотах більшою мірою для αS/ΔNt-Tau, ніж для αS/ΔNt-Tau.Не було чітких плям у краплинах систем pLK і Tau, нездатних до злиття/змочування.Щоб перевірити, чи є ці плями, що містять αS і Tau441, подібними до амілоїду агрегатами, ми провели подібний експеримент з використанням CF-мікроскопії, в якому Tau441 був позначений Atto647N і 12,5 мкМ амілоїд-специфічного тіофлавіну-T (ThT) було додано з самого початку.барвник.Хоча ThT-фарбування крапель αS/Tau441 або рафтів не спостерігалося навіть після 24 годин інкубації (рис. 5b, верхній ряд — краплі, що залишилися над білковими рафтами), ThT-позитивні структури, що містять Atto647N-Tau441 всередині рафтів, були дуже слабкими.це повторює розмір, форму та розташування раніше описаних плям (рис. 5b, середній і нижній ряди), припускаючи, що плями можуть відповідати амілоїдно-подібним агрегатам, утвореним у коацерватах старіння рідини.
WF 25 мкМ αS за різного часу інкубації та фокусної висоти (z, відстань від незв’язаного дна) у присутності 25 мкМ Tau441 (1 мкМ αS, міченого AF488 і Tau441, міченого Atto647N) в лунці планшета мікроскопа з буфером LLPS) .Шість експериментів були незалежно повторені з подібними результатами.b Мікроскопічне зображення CF 25 мкМ αS у присутності 25 мкМ Tau441 (1 мкМ Tau441, міченого Atto647N) і 12,5 мкМ тіофлавіну-Т (ThT).Зважені білкові краплі та відкладені білкові плоти та плями показані у верхньому та середньому рядках відповідно.У нижньому рядку показано зображення плотів і крапель із 3 незалежних копій.Білі стрілки вказують на ThT-позитивні точки на обох панелях.Масштабна шкала для всіх зображень становить 20 мкм.
Щоб більш детально вивчити зміни в білковій мережі коацервату під час переходу з рідкого стану в твердий, ми використали флуоресцентну візуалізацію протягом життя (FLIM) і резонансну мікроскопію переносу енергії Ферстера (FRET) (рис. 6 і додаткові малюнки 8 і 9).Ми припустили, що коацерватне дозрівання шару в більш конденсовану або навіть твердоподібну структуру агрегованого білка призводить до більш тісного контакту між білком і флуоресцентним зондом, прикріпленим до нього, потенційно створюючи ефект гасіння, що проявляється у скороченні тривалості життя зонда (τ) , як описано раніше40.,41 ,42.Крім того, для подвійно мічених зразків (AF488 і Atto647N як донорні та акцепторні барвники FRET відповідно) це зниження τ також може супроводжуватися конденсацією коацервату та підвищенням ефективності FRET(E) під час LSPT.Ми спостерігали за утворенням рафта та плями протягом тривалого часу в зразках LLPS αS/Tau441 та αS/ΔNt-Tau (25 мкМ кожного білка в буфері LLPS, що містить 1 мкМ AF488, поміченого αS та/або Atto647N, поміченого Tau441 або ΔNt-Tau).Ми спостерігали загальну тенденцію щодо того, що тривалість життя флуоресценції зондів AF488 (τ488) і Atto647N (τ647N) трохи зменшувалася в міру дозрівання коацерватів (рис. 6 і додаткова рис. 8c).Цікаво, що ця зміна була значно посилена для точок у плотах (рис. 6c), що вказує на те, що подальша конденсація білка відбувалася в точках.На підтвердження цього не спостерігалося суттєвої зміни тривалості флуоресценції для крапель αS/ΔNt-Tau, витриманих протягом 24 годин (додатковий рис. 8d), що свідчить про те, що гелеутворення крапель є процесом, відмінним від плямистості, і який не супроводжується значною молекулярною реорганізацією всередині коацерватів.Слід зазначити, що точки мають різні розміри та змінний вміст у αS, особливо для системи αS/Tau441 (додатковий рис. 8e).Зменшення тривалості життя плямової флуоресценції супроводжувалося збільшенням інтенсивності, особливо для Atto647N, позначеного Tau441 (додаткова рис. 8a), і вищою ефективністю FRET для систем αS/Tau441 і αS/ΔNt-Tau, що вказує на подальшу конденсацію в LLPS П’ять годин після спрацьовування білки всередині статичної електрики конденсувалися.Порівняно з αS/ΔNt-Tau ми спостерігали нижчі значення τ647N і дещо вищі значення τ488 у плямах αS/Tau441, що супроводжувалося нижчими та більш неоднорідними значеннями FRET.Можливо, це може бути пов’язано з тим фактом, що в системі αS/Tau441 спостережувана та очікувана кількість αS в агрегатах є більш неоднорідною, часто субстехіометричною порівняно з Tau, оскільки сам Tau441 також може піддаватися LLPS та агрегації (додатковий рис. 8e) .Однак ступінь злиття крапель, утворення плоту і, що важливо, агрегації білка в рідиноподібних коацерватах є максимальним, коли присутні як Tau441, так і αS.
Довічна флуоресцентна мікроскопія (FLIM) зображення αS/Tau441 і αS/ΔNt-Tau при 25 мкМ кожного білка (1 мкМ AF488-міченого αS і 1 мкМ Atto647N-міченого Tau441 або ΔNt-Tau) у буфері LLPS.Стовпці показують репрезентативні зображення зразків LLPS за різного часу дозрівання (30 хв, 5 год і 24 год).Червона рамка показує область, що містить плями αS/Tau441.Тривалість життя показана кольоровими смугами.Масштаб = 20 мкм для всіх зображень.b Збільшене зображення FLIM вибраної області, показано в червоному полі на панелі a.Діапазони життя показані з використанням тієї ж колірної шкали, що й на панелі a.Масштабна шкала = 5 мкм.c Гістограми, що показують AF488 (приєднаний до αS) або Atto647N (приєднаний до Tau) для різних видів білка (крапельки-D-, рафт-R- і спекл-P), ідентифікованих на зображеннях FLIM, записаних для αS-), часових розподілів часу життя Tau441 і Зразки коацервату αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI для D, 29-44 ROI для R і 21-51 ROI для точок).Середні та медіанні значення показані жовтими квадратами та чорними лініями всередині прямокутників відповідно.Нижня та верхня межі прямокутника представляють перший та третій квартилі відповідно, а мінімальне та максимальне значення в межах 1,5-кратного інтерквартильного діапазону (IQR) показані як вуса.Викиди показані чорними ромбами.Статистичну значущість між парами розподілів визначали за допомогою двовибіркового t-критерію, припускаючи нерівні дисперсії.Двосторонній t-критерій p-значення показані зірочками для кожної пари порівнюваних даних (* p-значення > 0,01, ** p-значення > 0,001, *** p-значення > 0,0001, **** p-value > 0,00001), ns Вказує на незначність (p-value > 0,05).Точні значення p наведені в додатковій таблиці 1, а вихідні дані представлені у вигляді файлів необроблених даних.
Щоб додатково продемонструвати амілоїдоподібну природу плям/агрегатів, ми обробляли незабарвлені зразки коацерватів протягом 24 годин високими концентраціями (1 М) NaCl, що призвело до відділення агрегатів від білкових коацерватів.Коли ізольовані агрегати (тобто диспергований розчин агрегатів) спостерігали за допомогою атомно-силової мікроскопії (АСМ), ми спостерігали переважно сферичну морфологію з регулярною висотою близько 15 нм, яка має тенденцію до асоціації в умовах високої концентрації солі, подібно до поведінка типових амілоїдних фібрил через сильний гідрофобний ефект на поверхні (зауважте, що фібрили зазвичай мають висоту ~10 нм) (додатковий рис. 10а).Цікаво, що коли ізольовані агрегати інкубували з ThT у стандартному аналізі флуоресценції ThT, ми спостерігали різке збільшення квантового виходу флуоресценції ThT, порівнянне з тим, що спостерігали, коли барвник інкубували з типовими амілоїдними фібрилами αS (додатковий рис. 10b), що свідчить про те, що коацерватні агрегати містять амілоїдоподібні структури..Фактично, агрегати були толерантними до високих концентрацій солі, але чутливими до 4 М гуанідин хлориду (GdnHCl), як типові амілоїдні фібрили (додаткова рис. 10c).
Далі ми проаналізували склад агрегатів за допомогою флуоресценції однієї молекули, специфічної флуоресцентної кореляційної/крос-кореляційної спектроскопії (FCS/FCCS) і пакетного аналізу виявлення збігу двох кольорів (TCCD).З цією метою ми виділили агрегати, що утворилися після 24 годин інкубації в 100 мкл зразків LLPS, що містять αS і Tau441 (обидва 25 мкМ) разом з 1 мкМ AF488-міченим αS і 1 мкМ Atto647N-міченим Tau441.Розведіть отриманий розчин диспергованого агрегату до мономолекулярного стану, використовуючи той самий буфер, що не містить ПЕГ, і 1 М NaCl (той самий буфер, який використовується для відділення агрегатів від коацервату), щоб запобігти будь-яким можливим електростатичним взаємодіям між LLPS і білком.Приклад часової траєкторії однієї молекули можна побачити на рис. 7а.Аналіз FCCS/FCS (перехресна кореляція, CC і автокореляція, AC) показав, що агрегати, що містять αS і тау, були у великій кількості в зразках (див. криву CC на рис. 7b, ліва панель), і надлишок залишкового мономерного білка виник як результат процесу розведення (див. криві AC на малюнку 7b, ліва панель).Контрольні експерименти, проведені в тих самих умовах розчину з використанням зразків, що містять лише мономерні білки, не показали кривих CC, а криві AC добре відповідають моделі однокомпонентної дифузії (Рівняння 4), де мономерні білки мають очікувані коефіцієнти дифузії (рис. 7b). ), праву панель).Коефіцієнт дифузії агрегованих частинок менше 1 мкм2/с, а мономерних білків — близько 1 мкм2/с.50–100 мкм/с;значення подібні до раніше опублікованих значень для оброблених ультразвуком амілоїдних фібрил αS і мономерного αS окремо в аналогічних умовах розчину44.Коли ми проаналізували агрегати за допомогою аналізу вибуху TCCD (рис. 7c, верхня панель), ми виявили, що в кожному ізольованому агрегаті (αS/Tau гетероагрегат) близько 60% виявлених агрегатів містили як αS, так і тау, приблизно 30% містили лише тау, лише близько 10% αS.Стехіометричний аналіз гетероагрегатів αS/Tau показав, що більшість гетероагрегатів були збагачені тау (стехіометрія нижче 0,5, середня кількість молекул тау на агрегат у 4 рази більше, ніж молекули αS), що узгоджується з нашою роботою, спостережуваною в FLIM in situ експерименти..Аналіз FRET показав, що ці агрегати містили обидва білки, хоча фактичні значення FRET в цьому випадку не мають великого значення, оскільки розподіл флуорофорів у кожному агрегаті був випадковим через надлишок неміченого білка, який використовувався в експерименті.Цікаво, що коли ми виконали той самий аналіз, використовуючи варіант Тау з дефіцитом агрегації амілоїду 45,46 (див. Додатковий рис. 11a,b), ми помітили, що хоча електростатична агрегація αS була такою ж (Додаткова рис. 11c, d), здатність утворювати агрегати в коацерваті була різко знижена, і FLIM виявив кілька плям в експериментах in situ, а для ізольованих зразків агрегатів спостерігалися слабкі криві крос-кореляції.Однак для невеликої кількості виявлених агрегатів (лише одна десята Tau441) ми спостерігали, що кожен агрегат був збагачений αS, ніж цей варіант Tau, приблизно 50% виявлених агрегатів містили лише молекули αS, а αS був гетерогенним у надлишку. .агрегати (див. Додатковий рис. 11e), на відміну від гетерогенних агрегатів, створених Tau441 (рис. 6f).Результати цих експериментів показали, що хоча αS сам по собі здатний накопичуватися з тау в коацерваті, утворення зародків тау є більш сприятливим за цих умов, і отримані амілоїдноподібні агрегати здатні діяти як форма αS і тау.Однак, як тільки утворюється ядро, багате тау, гетеротипні взаємодії між αS і тау мають перевагу в агрегатах, ніж гомотипні взаємодії між молекулами тау;ми також спостерігаємо білкові мережі в рідких коацерватах αS/tau.
Репрезентативні часові сліди флуоресценції окремих молекул ізольованих агрегатів, утворених в електростатичних коацерватах αS/Tau441.Сплески, що відповідають коагрегатам αS/Tau441 (сплески вище вказаного порогу), спостерігалися в трьох каналах виявлення (випромінювання AF488 і Atto647N після прямого збудження, синя та червона лінії, випромінювання Atto647N після непрямого збудження), FRET, фіолетова лінія).b Аналіз FCS/FCCS зразка ізольованих агрегатів αS/Tau441, отриманих з LLPS (ліва панель).Криві автокореляції (AC) для AF488 і Atto647N показані синім і червоним кольором відповідно, а криві крос-кореляції (CC), пов’язані з агрегатами, що містять обидва барвники, показані фіолетовим кольором.Криві AC відображають присутність мічених мономерних і агрегованих видів білка, тоді як криві CC показують лише дифузію подвійно мічених агрегатів.Той самий аналіз, але за тих самих умов розчину, що і в ізольованих плямах, зразки, що містять лише мономерний αS і Tau441, показані як контролі на правій панелі.c Аналіз спалаху флуоресценції окремих молекул ізольованих агрегатів, утворених в електростатичних коацерватах αS/Tau441.Інформація для кожного агрегату, знайденого в чотирьох різних повторах (N = 152), наноситься на графік щодо їх стехіометрії, значень S та ефективності FRET (верхня панель, кольорова смуга відображає випадки).Можна виділити три типи агрегатів: -αS-тільки агрегати з S~1 і FRET~0, Tau-тільки агрегати з S~0 і FRET~1 і гетерогенні Tau/αS агрегати з проміжним S і FRET Оцінки кількості обох маркерних білків, виявлених у кожному гетерогенному агрегаті (N = 100), показано на нижній панелі (кольорова шкала відображає появу).Необроблені дані надаються у формі файлів необроблених даних.
Повідомлялося, що дозрівання або старіння рідких білкових конденсатів у гелеподібні або тверді структури з часом бере участь у кількох фізіологічних функціях конденсату47, а також у захворюваннях, як аномальний процес, що передує агрегації амілоїду 7, 48, 49. Тут ми детально вивчаємо розділення та поведінку фаз.LSPT αS у присутності випадкових полікатіонів у контрольованому середовищі при низьких мікромолярних концентраціях і фізіологічно відповідних умовах (зверніть увагу, що розрахована фізіологічна концентрація αS становить >1 мкМ50), дотримуючись типової термодинамічної поведінки LPS.Ми виявили, що αS, який містить сильно негативно заряджену С-кінцеву область при фізіологічному рН, здатний утворювати багаті білком краплі у водному розчині за допомогою LLPS у присутності висококатіонних невпорядкованих пептидів, таких як pLK або Tau, через процес електростатики. комплексна конденсація в присутності агрегаційних макромолекул.Цей процес може мати відповідні ефекти в клітинному середовищі, де αS стикається з різними полікатіонними молекулами, пов’язаними з його асоційованою із захворюванням агрегацією як in vitro, так і in vivo51,52,53,54.
У багатьох дослідженнях динаміка білка всередині крапель вважалася одним із ключових факторів, що визначають процес дозрівання55,56.В електростатичних коацерватах αS з полікатіонами процес дозрівання, очевидно, залежить від сили взаємодій з полікатіонами, валентності та кратності цих взаємодій.Теорія рівноваги припускає, що рівноважний ландшафт двох рідких станів був би присутністю великої краплі, багатої на біополімери, які керують LLPS57,58.Зростання крапель може бути досягнуто дозріванням Оствальда59, коалесценцією60 або споживанням вільного мономеру в дисперсійній фазі61.Для αS і Tau441, ΔNt-Tau або pLK більша частина білка була сконцентрована в конденсаті в умовах, використаних у цьому дослідженні.Однак, хоча повнорозмірні краплі тау швидко об’єднувалися при змочуванні поверхні, злиття крапель і змочування були складними для ΔNt-Tau і pLK, що свідчить про швидку втрату властивостей рідини в цих двох системах.Згідно з нашим аналізом FLIM-FRET, старі краплі pLK і ΔNt-Tau показали подібний ступінь агрегації білка (подібний час життя флуоресценції), як і вихідні краплі, що свідчить про те, що початкова білкова мережа була збережена, хоча і більш жорстка.
Ми раціоналізуємо наші експериментальні результати в наступній моделі (рис. 8).Спочатку тимчасово утворені краплі часто являють собою білкові мережі без електростатичної компенсації, і, таким чином, існують області дисбалансу заряду, особливо на межі крапель, що призводить до крапель з високим електростатичним потенціалом поверхні.Щоб компенсувати заряд (явище, яке зазвичай називають валентним зменшенням) і мінімізувати поверхневий потенціал крапель, краплі можуть містити нові поліпептиди з розведеної фази, реорганізовувати білкові мережі для оптимізації взаємодії заряд-заряд і взаємодіяти з іншими краплями.з поверхнями (змочування).Краплі αS/pLK завдяки своїй простішій білковій мережі (тільки гетеротипові взаємодії між αS і pLK) і більшій спорідненості до білок-білкових взаємодій, здається, здатні швидше збалансувати заряд конденсату;дійсно, ми спостерігали більш швидку кінетику білка в початково сформованих коацерватах αS/pLK, ніж у αS/Tau.Після виснаження валентності взаємодії стають менш ефемерними, і краплі втрачають свої властивості рідини та перетворюються на гелеподібні негорючі краплі з низьким електростатичним потенціалом поверхні (і тому нездатні змочувати поверхню).Навпаки, краплі αS/Tau менш ефективні в оптимізації балансу заряду крапель через більш складні білкові мережі (як з гомотипними, так і з гетеротипними взаємодіями) і слабшу природу білкових взаємодій.Це призводить до крапель, які зберігають рідку поведінку протягом тривалих періодів часу та демонструють високий електростатичний поверхневий потенціал, який має тенденцію мінімізувати шляхом злиття та зростання (таким чином мінімізуючи співвідношення площі поверхні/об’єму крапель) і шляхом змочування гідрофільної поверхні.Це створює великі концентровані білкові бібліотеки, які зберігають властивості рідини, оскільки взаємодії залишаються дуже тимчасовими через постійний пошук оптимізації заряду в білковій мережі.Цікаво, що N-кінцеві усічені форми тау, включаючи деякі природні ізоформи62, демонструють проміжну поведінку, при цьому деякі коацервати старіють з αS у довгоживучі гелеподібні краплі, тоді як інші перетворюються у великі рідкі конденсати.Ця подвійність у дозріванні електростатичних коацерватів αS узгоджується з недавніми теоретичними та експериментальними дослідженнями LLPS, які виявили кореляцію між виснаженням валентності та електростатичним просівом у конденсатах як ключ до контролю розміру конденсату та властивостей рідини.Механізм 58.61.
Ця схема показує передбачуваний шлях агрегації амілоїду для αS і Tau441 через LLPS і LSPT.Завдяки додатковим багатим на аніони (червоний) і багатим на катіони (синій) регіонам електростатичні коацервати αS і тау із задовільною валентністю мають нижчу поверхневу енергію і, отже, меншу коалесценцію, що призводить до швидкого старіння крапель.Досягається стабільний неагломерований стан гелю..Ця ситуація є дуже сприятливою у випадку системи αS/pLK завдяки її вищій спорідненості та простішій мережі взаємодії між білковими парами, що забезпечує швидкий гелеподібний перехід.Навпаки, краплі з незадовільною валентністю і, отже, білково зарядженими ділянками, доступними для взаємодії, полегшують коацервату злиття та змочування гідрофільної поверхні, щоб зменшити його високу поверхневу енергію.Ця ситуація краща для коацерватів αS/Tau441, які мають багатовалентну комплексну мережу, що складається зі слабких взаємодій Tau-Tau і αS-Tau.У свою чергу, більші коацервати легше збережуть свої властивості, подібні до рідини, дозволяючи виникати інші взаємодії між білками.Зрештою, амілоїдні гетерогенні агрегати, що містять як αS, так і тау, утворюються в коацерватній рідині, що може бути пов’язано з тими, що знаходяться в тільцях включення, які є ознаками нейродегенеративних захворювань.
Великі рідиноподібні структури, утворені під час дозрівання αS/Tau441 із сильно перевантаженим, але динамічним білковим середовищем і, меншою мірою, коацерватами αS/ΔNt-Tau є ідеальними резервуарами для зародження агрегації білка.Ми справді спостерігали утворення твердих білкових агрегатів у цьому типі білкових коацерватів, які часто містять як αS, так і тау.Ми показали, що ці гетероагрегати стабілізуються неелектростатичними взаємодіями, здатні зв’язувати амілоїдно-специфічні барвники ThT так само, як типові амілоїдні фібрили, і справді мають подібну стійкість до різних впливів.Показано, що агрегати αS/tau, утворені LLPS, мають амілоїдоподібні властивості.Дійсно, зрілий варіант Тау з дефіцитом амілоїдної агрегації значно порушується при формуванні цих гетерогенних агрегатів αS в рідкому електростатичному коацерваті.Утворення агрегатів αS/Tau441 спостерігалося лише всередині коацерватів, які зберігали рідиноподібні властивості, і ніколи, якщо коацервати/краплі не досягали стану гелю.В останньому випадку підвищена сила електростатичних взаємодій і, як наслідок, жорсткість білкової мережі запобігають необхідні конформаційні перебудови білків для встановлення нових білкових взаємодій, необхідних для зародження амілоїду.Однак цього можна досягти в більш гнучких, схожих на рідину коацерватах, які, у свою чергу, з більшою ймовірністю залишатимуться рідкими, коли збільшаться в розмірі.
Той факт, що утворення агрегатів у конденсованій фазі є кращим у великих конденсатах αS/Tau, ніж у маленьких краплинах, які швидко утворюють гель, підкреслює актуальність визначення факторів, які контролюють коалесценцію крапель.Таким чином, не тільки існує тенденція до поділу фаз, але розмір конденсату необхідно контролювати для належного функціонування, а також для запобігання захворюванням58,61.Наші результати також підкреслюють важливість балансу між LLPS і LSPT для системи αS/Tau.У той час як утворення крапель може захистити від агрегації амілоїду шляхом зменшення кількості білкових мономерів, доступних в умовах насичення, як було запропоновано в інших системах 63, 64, злиття крапель на високих рівнях крапель може призвести до внутрішньої агрегації білка через повільні конформаційні перебудови.білкові мережі..
Загалом, наші дані сильно підкреслюють актуальність когезійної валентності та задоволених/незадоволених взаємодій у мережах роз’єднання в контексті LSPT.Зокрема, ми показуємо, що повнорозмірні конденсати αS/Tau441 здатні ефективно зливатися та зароджуватися з утворенням амілоїдоподібних гетероагрегатів, які включають обидва білки, і пропонуємо молекулярний механізм на основі наших експериментальних результатів.Коагрегація двох білків у рідинному коацерваті αS/Tau, про яку ми повідомляємо тут, справді може бути пов’язана з спільною локалізацією двох білків у включеннях, які є характерними ознаками захворювання, і може сприяти розумінню зв’язку між LLPS та агрегація амілоїду, прокладаючи шлях для високозарядженого IDP у нейродегенерації.
Мономерний WT-αS, цистеїнові мутанти (Q24C-αS, N122C-αS) і варіанти ΔCt-αS (Δ101-140) експресували в E. coli та очищали, як описано раніше.5 мМ DTT було включено на всіх стадіях очищення мутантів αS-цистеїну, щоб запобігти утворенню дисульфідного зв’язку.Ізоформа Tau441 (плазміда, отримана з Addgene #16316), варіант ΔNt-Tau (Δ1–150, отриманий клонуванням IVA з праймерами CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) та варіант AggDef-Tau (Δ275–311, очищений GGCTC 5 праймер) Були культури E. coli виріс до OD600 = 0,6–0,7 при 37°C і 180 об/хв, і експресію індукували IPTG протягом 3 годин при 37°C.Збирайте клітини при 11500 xg протягом 15 хвилин при 4 °C і промивайте сольовим буфером, що містить 150 мМ NaCl.Ресуспендуйте осад у буфері для лізису (20 мл на 1 л LB: MES 20 мМ, pH 6,8, NaCl 500 мМ, EDTA 1 мМ, MgCl2 0,2 ​​мМ, DTT 5 мМ, PMSF 1 мМ, бензамідин 50 мкМ, копептин 100 мкМ).Етап обробки ультразвуком проводили на льоду з амплітудою 80% протягом 10 імпульсів (1 хв увімкнено, 1 хв вимкнено).Не перевищуйте 60 мл за одне УЗД.Лізати E.coli нагрівали при 95°C протягом 20 хвилин, потім охолоджували на льоду і центрифугували при 127000×g протягом 40 хвилин.Освітлений супернатант наносили на мембрану 3,5 кДа (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Великобританія) і діалізували проти 4 л діалізного буфера (20 мМ MES, pH 6,8, NaCl 50 мМ, EDTA 1 мМ, MgCl2 2 мМ, DTT 2 мМ , PMSF 0,1 мМ) протягом 10 годин.Катіонообмінну колонку об’ємом 5 мл (HiTrap SPFF, Cytiva, Массачусетс, США) врівноважували буфером для врівноваження (20 мМ MES, рН 6,8, 50 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 2 мМ MgCl2, 2 мМ DTT, 0,1 мМ PMSF).Тау-лізат фільтрували через фільтр PVDF 0,22 мкм і вводили в колонку зі швидкістю потоку 1 мл/хв.Елюювання проводили поступово, тау елюювали 15–30% буфером для елюції (20 мМ MES, pH 6,8, 1 М NaCl, 1 мМ EDTA, 2 мМ MgCl2, 2 мМ DTT, 0,1 мМ PMSF).Фракції аналізували за допомогою SDS-PAGE, і будь-які фракції, що містять одну смугу з очікуваною молекулярною масою тау, концентрували за допомогою центрифужного фільтра 10 кДа і замінювали буфером, що містить 10 мМ HEPES, pH 7,4, NaCl 500 мМ і DTT 2 мМ для кінцева концентрація білка становила 100 мкМ.Потім розчин білка пропускали через фільтр PVDF 0,22 мкм, швидко заморожували та зберігали при -80°C.Протеїн K18 люб'язно надав професор Альберто Боффі.Чистота препарату була >95%, що підтверджено SDS-PAGE та MALDI-TOF/TOF.Різні цистеїни були хімічно помічені AlexaFluor488-малеімідом (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, США) або TEMPOL-малеімідом (Toronto Research Chemicals, Торонто, Канада).були підтверджені абсорбцією та MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau і K18 були мічені нативними залишками цистеїну в положеннях 191 і 322 за допомогою Atto647N-малеіміду (ATTO-TEC GmbH, Зіген, Німеччина) за тією ж процедурою.Карти чистого заряду на залишки для αS і Tau441 були створені за допомогою CIDER66.
Твердий полі-L-лізин (pLK DP 90-110 згідно з ЯМР від постачальника, Alamanda Polymers Inc, Хантсвіль, Алабама, США) розчиняли в 10 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, концентрація pH від 7,4 до 10 мМ, обробляли ультразвуком протягом 5 хвилин на ультразвуковій водяній бані та зберігати при -20°C.ПЕГ-8, декстран-70, FITC-ПЕГ-10 (Biochempeg, Вотертаун, Массачусетс, США) і FITC-декстран-500 (Sigma-Aldrich, Сант-Луїс, Мічиган, США) є водорозчинними та широко поширеними в буфері LLPS.Діаліз видаляє забруднюючі солі.Потім їх фільтрували через шприцевий фільтр з розміром пор 0,22 мкм і їх концентрацію розраховували за допомогою рефрактометра (Mettler Toledo, Колумбус, Огайо, США).Зразки LLPS готували при кімнатній температурі в такому порядку: буфер і екструзію змішували і 1 мМ трис(2-карбоксиетил)фосфіну (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 мМ 2,2,2,2-(Ethane- 1,2-диилдинитрил) тетраоцтової кислоти (EDTA, карбоксинт) і суміші 1% інгібітору протеази (PMSF 100 мМ, бензимід 1 мМ, лейпептин 5 мкМ).Потім додається αS і злиті полікатіони (варіанти pLK або Tau).Для експериментів із часовими рядами тіофлавіну-Т (ThT, Carbosynth, Compton, Великобританія) використовуйте загальну концентрацію ThT, яка дорівнює половині концентрації αS.Обережно, але ретельно перемішайте зразки, щоб вони були однорідними.Концентрація кожного компонента змінювалася від експерименту до експерименту, як описано в розділі «Результати».Азид використовували в концентрації 0,02% (мас./об.), якщо тривалість експерименту перевищувала 4 години.Для всіх аналізів з використанням зразків LLPS дайте суміші врівноважитись протягом 5 хвилин перед аналізом.Для аналізу світлорозсіювання 150 мкл зразків завантажували на незв’язувальні 96-лункові мікропланшети (µClear®, чорний, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Кремсмюнстер, Австрія) і покривали клейкою плівкою.LLP контролювали шляхом вимірювання поглинання при 350 нм у центрі розчину в планшетному рідері CLARIOstar (BMG Labtech, Ортенберг, Німеччина).Експерименти проводили в трьох повторах при 25°C, і помилки розраховували як стандартне відхилення від середнього.Розведену фазу кількісно визначали за допомогою центрифугування зразка та SDS-PAGE аналізу гелю, а фракцію αS у розведеній і концентрованій фазах визначали кількісно в різних розчинах LLPS.100 мкл зразка LLPS, що містить 1 мкМ αS, міченого AF488, готували шляхом ретельного змішування з подальшим центрифугуванням при 9600×g протягом 30 хвилин, після чого зазвичай було видно осад.Верхні 50 мкл супернатанту використовували для кількісного визначення білка за допомогою гелю SDS-PAGE.Гелі сканували за допомогою фільтрів AF488 за допомогою системи візуалізації гелю ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Геркулес, Каліфорнія, США) або фарбували кумасі та візуалізували за допомогою відповідних фільтрів.Отримані смуги аналізували за допомогою ImageJ версії 1.53i (Національний інститут охорони здоров'я, США).Експерименти проводили в двох примірниках у двох різних експериментах з подібними результатами.
Як правило, 150 мкл зразків наносили на незв’язувальні 96-лункові мікропланшети та візуалізували при кімнатній температурі на інвертованому мікроскопі Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Німеччина).Для точкових експериментів також використовували планшети µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Німеччина) або 96-лункові полістирольні мікропланшети (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).Як джерело освітлення використовувалися галогенні або ртутні металогалогенні лампи EL6000 (для BF/DIC та WF зображення відповідно).Для WF-мікроскопії використовували повітряний об’єктив із 40-кратним збільшенням (Leica Microsystems, Німеччина), щоб сфокусувати світло на зразку та зібрати його.Для зразків, позначених AF488 і ThT, фільтруйте збудження та випромінювання за допомогою стандартних наборів фільтрів GFP, смугових фільтрів збудження та випромінювання відповідно, смугових фільтрів 460–500 нм і 512–542 нм і дихроїчного дзеркала 495 нм.Для зразків, мічених Atto647N, використовувався стандартний набір фільтрів Cy5 зі смуговими фільтрами збудження та випромінювання 628–40 нм і 692–40 нм відповідно, а також дихроїчне дзеркало 660 нм.Для BF та DIC мікроскопії використовуйте той самий об’єктив для збору відбитого світла.Зібране світло записували на камеру Leica DFC7000 CCD (Leica Microsystems, Німеччина).Час експозиції становив 50 мс для BF та DIC-мікроскопії та 20-100 мс для WF-мікроскопії.Для порівняння, час експозиції для всіх експериментів з ThT становив 100 мс.Були проведені експерименти з уповільненою зйомкою, щоб візуалізувати коалесценцію крапель, із зображеннями, які збиралися кожні 100 мс протягом кількох хвилин.Для аналізу зображень використовували ImageJ (NIH, США).Експерименти проводили в трьох примірниках з однаковими результатами.
Для експериментів із колокалізацією, FRAP та 3D-реконструкцією зображення були отримані на інвертованому конфокальному мікроскопі Zeiss LSM 880 з використанням ZEN 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Німеччина).Зразки об’ємом 50 мкл наносили на чашки Петрі µ-Slide Angiogenesis (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Німеччина), оброблювали гідрофільним полімером (ibiTreat) і встановлювали в масляний імерсійний об’єктив 63× (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) на ДВС).Зображення були отримані з використанням ліній аргонового лазера з довжиною хвилі 458 нм, 488 нм і 633 нм з роздільною здатністю 0,26 мкм/піксель і часом експозиції 8 мкс/піксель для вікон виявлення збудження та випромінювання 470–600 нм, 493–628 нм, і 638–755 нм використовувався для візуалізації ThT, AF488 і Atto647N відповідно.Для експериментів FRAP сповільнена зйомка кожного зразка була записана зі швидкістю 1 кадр на секунду.Експерименти проводили в трьох повторах при кімнатній температурі з аналогічними результатами.Усі зображення були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення Zen 2 blue edition (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Німеччина).Криві FRAP були нормалізовані, нанесені та підігнані до даних інтенсивності/часу, отриманих із зображень за допомогою Zen 2 з використанням OriginPro 9.1.Криві відновлення були підігнані до моноекспоненціальної моделі для врахування молекулярної дифузії з додатковим експоненціальним членом для врахування ефекту відбілювання.Потім ми розрахували D, використовуючи номінальний радіус відбілювання та попередньо визначений період напіввиведення, як у рівнянні Kang et al.5 35 показано.
Поодинокі цистеїнові варіанти αS були синтезовані з 4-гідрокси-2,2,6,6-тетраметилпіперидин-N-оксилом (TEMPOL) у положеннях 24 (TEMPOL-24-αS) і 122 (TEMPOL-122-αS), відповідно.Спінове мічення Для експериментів EPR концентрація αS була встановлена ​​на 100 мкМ, а концентрація PEG становила 15% (мас./об.).Для різних умов агрегації співвідношення αS:pLK становило 1:10, тоді як співвідношення αS:ΔNt-Tau і αS:Tau441 підтримувалося на рівні 1:1.Для експериментів титрування зв’язування за відсутності скупчення TEMPOL-122-αS підтримували на рівні 50 мкМ, а полікатіони титрували при зростаючих концентраціях, готуючи кожну умову окремо.Вимірювання CW-EPR проводили за допомогою спектрометра X-діапазону Bruker ELEXSYS E580, оснащеного резонатором Bruker ER4118 SPT-N1, що працює на частоті мікрохвиль (SHF) ~9,7 ГГц.Температуру встановлювали на рівні 25°C і контролювали за допомогою кріостата рідкого азоту.Спектри отримані в ненасичених умовах при потужності МВт 4 мВт, амплітуді модуляції 0,1 мТл і частоті модуляції 100 кГц.Спектральні інтенсивності були нормалізовані, щоб уникнути відмінностей у спінових концентраціях між зразками та можливого зменшення спіну через залишкові концентрації відновників у зразках, що містять Tau441 або ΔNt-Tau (присутні у вихідних білкових розчинах).Наведені значення g були отримані в результаті спектрального моделювання ЕПР, виконаного за допомогою програмного забезпечення Easyspin (v. 6.0.0-dev.34), реалізованого в Matlab®67.Для моделювання даних використовували одно/двокомпонентні ізотропні моделі.Після нормалізації всіх сигналів залишки були розраховані шляхом віднімання кожного моделювання з відповідного експериментального спектру.Для аналізу титрування зв’язування використовували відносну інтенсивність третьої смуги до другої смуги нормалізованого спектру ЕПР (III/III) для моніторингу зв’язування полікатіонів з αS.Щоб оцінити константу дисоціації (Kd), отриману криву підігнали до наближеної моделі, припускаючи n ідентичних і незалежних сайтів зв’язування.
Експерименти ЯМР-спектроскопії проводили з використанням ЯМР-спектрометра Bruker Neo 800 МГц (1H), оснащеного кріозондом і Z-градієнтом.Усі експерименти проводили з використанням 130–207 мкМ αS і відповідних еквівалентів αS/ΔNt-Tau та pLK у 10 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, 10% DO, pH 7,4 і проводили при 15°C.Для моніторингу LPS за допомогою ЯМР до ​​попередньо змішаних зразків додавали 10% PEG.Діаграма збурення хімічного зсуву (рис. 1b) показує середні хімічні зсуви 1H і 15N.Спектри αS 2D1H-15N HSQC були призначені на основі попереднього призначення (запис BMRB № 25227) і підтверджені записом і аналізом 3D-спектрів HNCA, HNCO і CBCAcoNH.Хімічні зсуви 13Cα і 13Cβ були розраховані в присутності ΔNt-Tau або pLK для вимірювання можливих змін у тенденціях вторинної структури порівняно з хімічними зрушеннями αS у чистій випадковій конформації спіралі 68 (додатковий малюнок 5c).Швидкості R1ρ вимірювали шляхом запису експериментів hsqctretf3gpsi (отриманих з бібліотеки Bruker) із затримками 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 і 800 мс, а експоненціальні функції були скориговані до пікових затримок інтенсивності при різних разів для визначення R1ρ та його експериментальної невизначеності.
Експерименти двоколірної флуоресцентної мікроскопії з часовим розділенням проводили на комерційному флуоресцентному конфокальному мікроскопі MT200 з часовим розділенням (PicoQuant, Берлін, Німеччина) з пристроєм підрахунку одиночних фотонів із корельованим часом (TCSPC).Головка лазерного діода використовується для імпульсного перемежованого збудження (PIE), промінь проходить через одномодовий хвилевід і налаштовується на потужність лазера від 10 до 100 нВт для лазерних ліній 481 нм і 637 нм, виміряних після дихроїчного дзеркала.Це забезпечує оптимальну швидкість підрахунку фотонів, уникаючи ефектів згладжування фотонів, фотознебарвлення та насичення.Покривні скельця або пластини для ангіогенезу μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Німеччина) поміщали безпосередньо у воду для занурення над лінзою Super Apochromat 60x NA 1.2 з коригуючим коміром (Olympus Life Sciences, Waltham, США).Дихроїчне дзеркало 488/640 нм (Semrock, Лейк-Форест, штат Іллінойс, США) використовувалося як дільник основного променя.Несфокусоване випромінювання блокується отвором діаметром 50 мкм, потім сфокусоване випромінювання розділяється на 2 шляхи детектування світлорозділювачем 50/50.Смугові фільтри випромінювання (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 для зеленого барвника (AF488) і 690/70 для червоного барвника (Atto647N) використовувалися перед детектором.Як детектори використовували однофотонні лавинні діоди (SPAD) (Micro Photon Devices, Больцано, Італія).Збір і аналіз даних проводили за допомогою комерційно доступного програмного забезпечення SymphoTime64 (PicoQuant GmbH, Берлін, Німеччина).
П’ятдесят мікролітрів зразків LLPS наносили в лунки ангіогенезу μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Німеччина).Отримані зображення фокусуються до 20 мкм над дном колодязя для оптимальної робочої відстані об’єктива для зважених крапель і до ~1 мкм для плотів і точок з осьовою роздільною здатністю щонайменше 0,25 мкм/піксель і часом затримки 400 мкс/піксель.Виберіть дані, застосовуючи порогове значення інтенсивності на основі середньої інтенсивності фонового сигналу (PBG, середнє + 2σ) для кожного каналу, щоб вибирати лише краплі рідкого білка, плоти або плями, відфільтровуючи будь-яке можливе походження з дисперсної фази.Щоб проаналізувати тривалість життя кожного виду (τ) кожного каналу (зелений, «g» для AF488 і червоний, «r» для Atto647N), ми вибрали цікаві області (ROI), що містять краплі, плоти або плями (додатковий малюнок 1). ).8b) і отримав їх шляхом підгонки їх розпаду протягом життя (τD, τR і τP для крапель, плотів або плям, відповідно, див. Додатковий рис. 8c) у кожному каналі, використовуючи аналіз хвостової відповідності та двокомпонентну модель розпаду.Середнє τ від τ .ROI, які виробляли занадто мало фотонів для мультиекспоненціального підбору, були виключені з аналізу.Використане обмеження становило <104 фотонів для плотів і точок і 103 для крапель.Краплі мають нижчий поріг, оскільки важко отримати криві розпаду з більш високими значеннями інтенсивності, оскільки краплі в полі зображення зазвичай менші та менші.ROI з кількістю фотонів, що перевищує ліміт накопичення фотонів (встановлений на >500 одиниць/піксель), також були відкинуті для аналізу.Зіставте криву спаду інтенсивності, отриману в області інтересу, з інтенсивністю на рівні 90% від максимуму (трохи після максимальної інтенсивності спаду) від початку терміну служби, щоб забезпечити мінімальну інтерференцію IRF, зберігаючи однакову для всіх спадів інтенсивності параметри Відносне часове вікно Було проаналізовано від 25 до 50 ROI для плотів і плям і 15-25 ROI для крапель, зображень, вибраних з більш ніж 4 повторень, записаних принаймні 3 незалежних експериментів.Для оцінки статистичних відмінностей між видами або між коацерватними системами використовували двосторонні t-тести.Для попіксельного аналізу тривалості життя (τ) було розраховано загальне загасання часу життя за полем для кожного каналу та виконано апроксимацію 2/3-компонентної моделі експоненціального загасання.Потім загасання за тривалість життя для кожного пікселя було підігнано з використанням попередньо розрахованих значень τ, що призвело до отримання псевдокольорового зображення FLIM.Діапазон тривалості життя хвостової відповідності був однаковим для всіх зображень одного каналу, і кожен розпад виробляв достатню кількість фотонів для забезпечення надійної відповідності.Для аналізу FRET пікселі були обрані шляхом застосування нижнього порогу інтенсивності 100 фотонів, що усереднювало фоновий сигнал (FBG) 11 фотонів.Інтенсивність флуоресценції кожного каналу була скоригована експериментально визначеними поправочними коефіцієнтами: 69 спектральних перехресних перешкод α становив 0,004, пряме збудження β становив 0,0305, ефективність виявлення γ становила 0,517.Тоді ефективність FRET на рівні пікселів обчислюється за допомогою наступного рівняння:
де FDD — інтенсивність флуоресценції, що спостерігається в донорному (зеленому) каналі, FDA — інтенсивність флуоресценції, що спостерігається в акцепторному (червоному) каналі при непрямому збудженні, а FAA — інтенсивність флуоресценції, що спостерігається в акцепторному (червоному) каналі при прямому збудженні ( ПИРІГ).У каналі спостерігаються імпульси інтенсивності флуоресценції).
Помістіть 100 мкл реакційних розчинів LLPS, що містять 25 мкМ неміченого мономерного Tau441 (з або без 25 мкМ αS) у буфері LLPS (доповненому, як зазначено вище) на незв’язувальні 96-лункові мікропланшети з адгезивним покриттям з фольги та утворення крапель перевіряли за допомогою WF мікроскопії після врівноваження.протягом 10 хв.Після 48 годин інкубації при кімнатній температурі було підтверджено наявність білкових рафтів і плям.Потім обережно видаліть рідину над плотами з лунок, потім додайте 50 л буфера для дисоціації (10 мМ HEPES, pH 7,4, 1 М NaCl, 1 мМ DTT) та інкубуйте протягом 10 хв.Висока концентрація солі гарантує, що LLPS не повторюватиметься через залишковий PEG, а можливі збірки білків, утворені лише електростатичними взаємодіями, будуть розібрані.Потім дно лунки обережно зскребли наконечником мікропіпетки, а отриманий розчин перенесли в порожню спостережну лунку.Після інкубації зразків з 50 мкМ ThT протягом 1 години наявність ізольованих плям перевіряли за допомогою WF мікроскопії.Приготуйте оброблені ультразвуком фібрили αS шляхом інкубації 300 мкл 70-мкМ розчину αS у PBS з pH 7,4, азидом натрію 0,01% при 37 °C і 200 об/хв на орбітальному шейкері протягом 7 днів.Потім розчин центрифугували при 9600×g протягом 30 хв, осад ресуспендували в PBS pH 7,4 і обробили зразки фібрил ультразвуком (1 хв, 50% цикл, 80% амплітуда в ультразвуковому апараті Vibra-Cell VC130, Sonics, Ньютон, США). з відносно рівномірним розподілом дрібних фібрил за розміром.
Аналіз FCS/FCCS і виявлення двокольорового збігу (TCCD) проводили на тому ж флуоресцентному конфокальному мікроскопі MT200 з роздільною здатністю в часі (Pico-Quant, Берлін, Німеччина), який використовувався для мікроскопічних експериментів FLIM-FRET з використанням режиму PIE.Потужність лазера для цих експериментів була додана до 6,0 мкВт (481 нм) і 6,2 мкВт (637 нм).Поєднання цих потужностей лазера було вибрано для отримання однакової яскравості для пар флуорофорів, що використовуються, при досягненні оптимальної швидкості підрахунку та уникненні фотовідбілювання та насичення.Збір і аналіз даних проводили за допомогою комерційно доступного програмного забезпечення SymphoTime64 версії 2.3 (PicoQuant, Берлін, Німеччина).
Зразки ізольованих агрегатів αS/Tau, отриманих за допомогою LLPS, розводять у буфері для виділення до відповідної мономолекулярної концентрації (зазвичай розведення 1:500, оскільки агрегати вже знаходяться в низьких концентраціях при виділенні зі зразків коацервату).Зразки наносили безпосередньо на покривні скельця (Corning, США), попередньо вкриті розчином BSA у концентрації 1 мг/мл.
Для аналізу PIE-smFRET у зеленому та червоному каналах було застосовано нижчий поріг інтенсивності 25 фотонів, щоб відфільтрувати сигнали низької інтенсивності, викликані мономерними подіями (зауважте, що кількість мономерів перевищує кількість агрегованих зразків порівняно з ізольованими агрегатами).Цей поріг був розрахований як п’ятикратна середня інтенсивність мономерного αS, отриманого в результаті аналізу чистих зразків мономерів, щоб спеціально вибрати агрегати для аналізу.Схема керування PIE разом із збором даних TSCPC уможливила застосування фільтра зважування протягом усього терміну служби, який допомагає усунути фонові та спектральні перехресні перешкоди.Інтенсивність спалаху, вибрану з використанням наведених вище порогів, була скоригована з використанням середнього фонового сигналу, визначеного з гістограм появи в порівнянні з інтенсивністю/біном зразків лише з буфером.Спалахи, пов’язані з великими агрегатами, зазвичай займають кілька послідовних бінів у часовій трасі (встановлюється на 1 мс).У цих випадках вибирали бункер максимальної міцності.Для FRET і стехіометричного аналізу використовувався теоретично визначений гамма-фактор γ (0,517).Спектральні перехресні перешкоди та внески прямого збудження є незначними (визначаються експериментально) при використовуваній потужності лазера збудження.Ефективність і стехіометрія FRET при вибуху розраховується наступним чином.