Дякуємо, що відвідали Nature.com.Ви використовуєте версію браузера з обмеженою підтримкою CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Крім того, щоб забезпечити постійну підтримку, ми показуємо сайт без стилів і JavaScript.
Повзунки, що показують три статті на слайді.Використовуйте кнопки «Назад» і «Далі» для переходу між слайдами або кнопки керування слайдами в кінці для переходу між слайдами.

317 Постачальники спіральних труб з нержавіючої сталі

Таблиця хімічного складу матеріалу з нержавіючої сталі

SPACA6 — це поверхневий білок, що експресується сперматозоїдом, який є критичним для злиття гамет під час статевого розмноження ссавців.Незважаючи на цю фундаментальну роль, специфічна функція SPACA6 погано вивчена.Ми з’ясовуємо кристалічну структуру позаклітинного домену SPACA6 з роздільною здатністю 2,2 Å, виявляючи дводоменний білок, що складається з чотириланцюгового пучка та Ig-подібних β-сендвічів, з’єднаних квазігнучкими лінкерами.Ця структура нагадує IZUMO1, інший білок, асоційований зі злиттям гамет, що робить SPACA6 і IZUMO1 членами-засновниками суперродини білків, пов’язаних із заплідненням, які тут називають суперродиною IST.Надсімейство IST структурно визначається його крученим пучком із чотирьох спіралей і парою дисульфідних зв’язків мотивів CXXC.Пошук людського протеома на основі структури AlphaFold виявив додаткові члени білка цієї надродини;зокрема, багато з цих білків беруть участь у злитті гамет.Структура SPACA6 та її зв’язок з іншими членами надродини IST забезпечують відсутню ланку в наших знаннях про злиття гамет ссавців.
Життя кожної людини починається з двох окремих гаплоїдних гамет: сперматозоїда батька та яйцеклітини матері.Цей сперматозоїд є переможцем інтенсивного процесу відбору, під час якого мільйони сперматозоїдів проходять через жіночі статеві шляхи, долають різноманітні перешкоди1 і зазнають здібностей, що покращує їх рухливість і процеси поверхневих компонентів2,3,4.Навіть якщо сперматозоїд і ооцит знаходять один одного, процес ще не закінчений.Яйцеклітина оточена шаром кумулюсних клітин і глікопротеїновим бар’єром під назвою «zona pellucida», через який сперматозоїди повинні пройти, щоб потрапити в ооцит.Сперматозоїди використовують комбінацію молекул поверхневої адгезії та пов’язаних із мембраною та секретованих ферментів для подолання цих останніх бар’єрів5.Ці молекули та ферменти в основному зберігаються у внутрішній мембрані та акросомальному матриксі та виявляються, коли зовнішня мембрана сперматозоїда лізується під час акросомальної реакції6.Останнім кроком у цій напруженій подорожі є злиття сперматозоїда та яйцеклітини, під час якого дві клітини зливають свої мембрани, щоб стати єдиним диплоїдним організмом7.Хоча цей процес є новаторським у відтворенні людини, необхідні молекулярні взаємодії недостатньо вивчені.
На додаток до запліднення гамет, хімічний процес злиття двох ліпідних подвійних шарів був широко вивчений.Загалом, злиття мембран є енергетично несприятливим процесом, який вимагає, щоб білковий каталізатор пройшов структурну зміну конформації, яка зближує дві мембрани, порушуючи їх безперервність і викликаючи злиття8,9.Ці білкові каталізатори відомі як фузогени і були знайдені в незліченних системах синтезу.Вони необхідні для проникнення вірусу в клітини хазяїна (наприклад, gp160 у ВІЛ-1, спалах у коронавірусах, гемаглютинін у вірусах грипу)10,11,12 плацентарний (синцитин)13,14,15 та злиття гамет у нижчих еукаріот ( HAP2/GCS1 у рослин, протистів і членистоногих) 16,17,18,19.Фузогени для людських гамет ще не виявлені, хоча було показано, що кілька білків є критичними для прикріплення та злиття гамет.CD9, що експресується в ооцитах, трансмембранний білок, необхідний для злиття гамет миші та людини, був першим відкритим 21,22,23.Хоча його точна функція залишається незрозумілою, роль в адгезії, структурі вогнищ адгезії на мікроворсинках яйцеклітини та/або правильній локалізації поверхневих білків ооцитів здається ймовірною 24,25,26.Двома найбільш типовими білками, які мають вирішальне значення для злиття гамет, є білок сперми IZUMO127 і білок ооцитів JUNO28, і їх взаємна асоціація є важливим кроком у розпізнаванні гамет і адгезії до злиття.Самці мишей з нокаутом Izumo1 і самки мишей з нокаутом Juno повністю стерильні, у цих моделях сперматозоїди потрапляють у перивітеліновий простір, але гамети не зливаються.Подібним чином, конфлюентність була зменшена, коли гамети обробляли антитілами проти IZUMO1 або JUNO27,29 в експериментах із запліднення людини in vitro.
Нещодавно була відкрита група білків, що експресуються спермою, фенотипово подібних до IZUMO1 і JUNO20,30,31,32,33,34,35.Протеїн 6, асоційований з акросомальною мембраною сперми (SPACA6), був визначений як необхідний для запліднення у великомасштабному дослідженні мутагенезу на мишах.Вставка трансгену в ген Spaca6 продукує неплавкі сперматозоїди, хоча ці сперматозоїди інфільтрують перівітелліновий простір 36 .Подальші дослідження нокауту на мишах підтвердили, що Spaca6 необхідний для злиття гамет 30,32.SPACA6 експресується майже виключно в яєчках і має структуру локалізації, подібну до IZUMO1, а саме всередині інтими сперматозоїдів перед акросомальною реакцією, а потім мігрує в екваторіальну область після акросомальної реакції 30,32.Гомологи Spaca6 існують у різних ссавців та інших еукаріотів 30, і їх важливість для злиття гамет людини була продемонстрована інгібуванням запліднення людини in vitro резистентністю до SPACA6 30 .На відміну від IZUMO1 і JUNO, деталі структури, взаємодії та функції SPACA6 залишаються неясними.
Щоб краще зрозуміти фундаментальний процес, що лежить в основі злиття людської сперми та яйцеклітин, що дозволить нам інформувати про майбутні розробки у плануванні сім’ї та лікуванні безпліддя, ми провели структурні та біохімічні дослідження SPACA6.Кристалічна структура позаклітинного домену SPACA6 демонструє чотириспіральний пучок (4HB) та імуноглобуліноподібний (Ig-подібний) домен, з’єднаний квазігнучкими ділянками.Як було передбачено в попередніх дослідженнях,7,32,37 доменна структура SPACA6 подібна до структури IZUMO1 людини, і два білки мають незвичайний мотив: 4HB із трикутною спіральною поверхнею та парою дисульфідних зв’язаних мотивів CXXC.Ми припускаємо, що IZUMO1 і SPACA6 тепер визначають більшу, структурно споріднену суперсімейство білків, пов’язаних зі злиттям гамет.Використовуючи особливості, унікальні для надродини, ми провели вичерпний пошук структурного протеома людини AlphaFold, визначивши додаткових членів цієї надродини, включаючи кількох членів, залучених до злиття гамет та/або запліднення.Тепер виявляється, що існує загальна структурна складка та суперсімейство білків, пов’язаних зі злиттям гамет, і наша структура надає молекулярну карту цього важливого аспекту механізму злиття гамет людини.
SPACA6 — це однопрохідний трансмембранний білок з одним N-зв’язаним гліканом і шістьма передбачуваними дисульфідними зв’язками (рис. S1a і S2).Ми експресували позаклітинний домен людського SPACA6 (залишки 27–246) у клітинах Drosophila S2 і очистили білок за допомогою афінної нікельової, катіонно-обмінної та ексклюзійної хроматографії (рис. S1b).Очищений ектодомен SPACA6 є дуже стабільним і однорідним.Аналіз із застосуванням ексклюзійної хроматографії в поєднанні з полігональним розсіюванням світла (SEC-MALS) виявив один пік з розрахованою молекулярною масою 26,2 ± 0,5 кДа (рис. S1c).Це узгоджується з розміром мономерного ектодомену SPACA6, що вказує на те, що олігомеризація не відбулася під час очищення.Крім того, спектроскопія кругового дихроїзму (CD) виявила змішану α/β структуру з температурою плавлення 51,3 °C (рис. S1d,e).Деконволюція спектрів CD виявила 38,6% α-спіральних і 15,8% β-ланцюгових елементів (рис. S1d).
Ектодомен SPACA6 був кристалізований за допомогою випадкової матриці посіву38, що призвело до отримання набору даних з роздільною здатністю 2,2 Å (таблиця 1 і малюнок S3).Використовуючи комбінацію даних молекулярної заміни на основі фрагментів і фазових даних SAD з експозицією броміду для визначення структури (таблиця 1 і малюнок S4), остаточна уточнена модель складається із залишків 27–246.На момент визначення структури не було доступних експериментальних структур або структур AlphaFold.Ектодомен SPACA6 має розміри 20 Å × 20 Å × 85 Å, складається з семи спіралей і дев'яти β-ланцюгів і має витягнуту третинну складку, стабілізовану шістьма дисульфідними зв'язками (рис. 1a, b).Слабка електронна щільність на кінці бічного ланцюга Asn243 вказує на те, що цей залишок є N-зв’язаним глікозилюванням.Структура складається з двох доменів: N-кінцевого чотириспірального пучка (4HB) і C-кінцевого Ig-подібного домену з проміжною шарнірною областю між ними (рис. 1c).
a Структура позаклітинного домену SPACA6.Смугова діаграма позаклітинного домену SPACA6, колір ланцюга від N до C-кінця від темно-синього до темно-червоного.Цистеїни, що беруть участь у дисульфідних зв’язках, виділені пурпуровим кольором.b Топологія позаклітинного домену SPACA6.Використовуйте ту саму колірну схему, що й на малюнку 1а.c позаклітинний домен SPACA6.Смужкові діаграми 4HB, шарнірного та Ig-подібного домену пофарбовані в помаранчевий, зелений та синій відповідно.Шари не намальовані в масштабі.
Домен 4HB SPACA6 включає чотири головні спіралі (спіралі 1–4), які розташовані у формі спіральної спіралі (рис. 2а), чергуючись між антипаралельними та паралельними взаємодіями (рис. 2b).Невелика додаткова одновиткова спіраль (спіраль 1′) прокладена перпендикулярно пучку, утворюючи трикутник зі спіралями 1 і 2. Цей трикутник дещо деформований у спірально-скрученій упаковці відносно щільної упаковки спіралей 3 і 4 ( рис. 2а).
4HB N-кінцева стрічкова діаграма.b Вид зверху пучка з чотирьох спіралей, кожна спіраль виділена темно-синім на N-кінці та темно-червоним на C-кінці.c Спіральна колісна діаграма зверху вниз для 4HB, де кожен залишок показаний у вигляді кола, позначеного однолітерним кодом амінокислоти;лише чотири амінокислоти у верхній частині колеса пронумеровані.Неполярні залишки пофарбовані в жовтий колір, полярні незаряджені залишки — у зелений, позитивно заряджені — у синій, негативно заряджені — у червоний колір.d Трикутні грані домену 4HB з 4HB помаранчевим і петлями зеленого кольору.Обидві вставки показують паличкоподібні дисульфідні зв’язки.
4HB зосереджений на внутрішньому гідрофобному ядрі, що складається в основному з аліфатичних і ароматичних залишків (рис. 2c).Ядро містить дисульфідний зв’язок між Cys41 і Cys55, який з’єднує спіралі 1 і 2 разом у верхній піднятий трикутник (рис. 2d).Два додаткових дисульфідних зв’язку утворилися між мотивом CXXC у Helix 1′ та іншим мотивом CXXC, знайденим на кінчику β-шпильки в шарнірній області (рис. 2d).Консервативний залишок аргініну з невідомою функцією (Arg37) розташований усередині порожнистого трикутника, утвореного спіралями 1′, 1 і 2. Аліфатичні атоми вуглецю Cβ, Cγ і Cδ Arg37 взаємодіють з гідрофобним ядром, а його гуанідинові групи циклічно переміщуються між спіралями 1′ і 1 через взаємодію між остовом Thr32 і бічним ланцюгом (рис. S5a,b).Tyr34 поширюється в порожнину, залишаючи дві невеликі порожнини, через які Arg37 може взаємодіяти з розчинником.
Ig-подібні β-сендвіч-домени є великою суперсімейством білків, які мають спільну рису двох або більше багатоланцюгових амфіпатичних β-листів, які взаємодіють через гідрофобне ядро ​​39. С-кінцевий Ig-подібний домен SPACA6 має таку ж структуру і складається з двох шарів (рис. S6a).Лист 1 є β-листом із чотирьох ланцюгів (ланцюгів D, F, H та I), де ланцюги F, H та I утворюють антипаралельну структуру, а ланцюги I та D беруть участь у паралельній взаємодії.Таблиця 2 являє собою невеликий антипаралельний дволанцюговий бета-лист (нитки E і G).Внутрішній дисульфідний зв’язок спостерігався між C-кінцем ланцюга E та центром ланцюга H (Cys170-Cys226) (рис. S6b).Цей дисульфідний зв’язок аналогічний дисульфідному зв’язку в β-сендвіч-домені імуноглобуліну40,41.
Чотирьохнитковий β-лист скручується по всій довжині, утворюючи асиметричні краї, що відрізняються за формою та електростатикою.Тонший край — це плоска гідрофобна поверхня навколишнього середовища, яка виділяється порівняно з іншими нерівними та електростатично різними поверхнями в SPACA6 (рис. S6b,c).Ореол відкритих карбонільних/аміногруп і полярних бічних ланцюгів оточує гідрофобну поверхню (рис. S6c).Ширший край покритий закритим спіральним сегментом, який блокує N-кінцеву частину гідрофобного ядра та утворює три водневі зв’язки з відкритою полярною групою скелета F-ланцюга (рис. S6d).С-кінцева частина цього краю утворює велику кишеню з частково відкритим гідрофобним ядром.Кишеня оточена позитивними зарядами завдяки трьом наборам подвійних залишків аргініну (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 і Arg212-Arg214) і центрального гістидину (His220) (Малюнок S6e).
Шарнірна область — це короткий сегмент між спіральним доменом і Ig-подібним доменом, що складається з одного антипаралельного триланцюгового β-шару (нитки A, B і C), невеликої 310 спіралі та кількох довгих випадкових спіральних сегментів.(Рис. S7).Мережа ковалентних і електростатичних контактів у шарнірній області, здається, стабілізує орієнтацію між 4HB і Ig-подібним доменом.Мережу можна розділити на три частини.Перша частина включає два мотиви CXXC (27CXXC30 і 139CXXC142), які утворюють пару дисульфідних зв’язків між β-шпилькою в шарнірі та спіраллю 1′ у 4HB.Друга частина включає електростатичну взаємодію між Ig-подібним доменом і шарніром.Glu132 у шарнірі утворює сольовий місток з Arg233 у Ig-подібному домені та Arg135 у шарнірі.Третя частина включає ковалентний зв'язок між Ig-подібним доменом і шарнірною областю.Два дисульфідні зв’язки (Cys124-Cys147 і Cys128-Cys153) з’єднують шарнірну петлю з лінкером, який стабілізується електростатичними взаємодіями між Gln131 і функціональною групою скелета, що забезпечує доступ до першого Ig-подібного домену.ланцюг.
Структуру ектодомену SPACA6 та окремі структури 4HB та Ig-подібних доменів використовували для пошуку структурно подібних записів у базах даних білків 42 .Ми визначили збіги з високими балами Dali Z, малими стандартними відхиленнями та великими балами LALI (останній є кількістю структурно еквівалентних залишків).Хоча перші 10 звернень із повного пошуку ектодоменів (Таблиця S1) мали прийнятний Z-показник >842, пошук лише для 4HB або Ig-подібного домену показав, що більшість цих звернень відповідали лише β-сендвічам.повсюдна складка, виявлена ​​в багатьох білках.Усі три пошуки в Dali дали лише один результат: IZUMO1.
Давно припускали, що SPACA6 і IZUMO1 мають структурну подібність7,32,37.Хоча ектодомени цих двох білків, асоційованих зі злиттям гамет, мають лише 21% ідентичності послідовності (рис. S8a), складні докази, включаючи збережений патерн дисульфідного зв’язку та передбачуваний С-кінцевий Ig-подібний домен у SPACA6, дозволили ранні спроби створити модель гомології миші A a SPACA6 з використанням IZUMO1 як шаблону37.Наша структура підтверджує ці прогнози та показує справжній ступінь подібності.Фактично, структури SPACA6 і IZUMO137,43,44 мають однакову дводоменну архітектуру (рис. S8b) з подібними 4HB і Ig-подібними β-сендвіч-доменами, з’єднаними шарнірною областю (рис. S8c).
IZUMO1 і SPACA6 4HB мають спільні відмінності від звичайних спіральних пучків.Типові 4HB, подібні до тих, що знаходяться в білкових комплексах SNARE, залучених в ендосомальне злиття 45, 46, мають рівномірно розташовані спіралі, що зберігають постійну кривизну навколо центральної осі 47. Навпаки, спіральні домени в IZUMO1 і SPACA6 були спотворені, зі змінною кривизною та нерівномірна упаковка (Малюнок S8d).Скручування, ймовірно викликане трикутником, утвореним спіралями 1', 1 і 2, зберігається в IZUMO1 і SPACA6 і стабілізується тим самим мотивом CXXC на спіралі 1'.Однак додатковий дисульфідний зв’язок, виявлений у SPACA6 (Cys41 і Cys55 ковалентно зв’язують спіралі 1 і 2 вище) створює гострішу вершину на вершині трикутника, що робить SPACA6 більш скрученим, ніж IZUMO1, з більш вираженими трикутниками порожнини.Крім того, у IZUMO1 відсутній Arg37, який спостерігається в центрі цієї порожнини в SPACA6.Навпаки, IZUMO1 має більш типове гідрофобне ядро ​​з аліфатичних і ароматичних залишків.
IZUMO1 має Ig-подібний домен, що складається з дволанцюгового та п’ятиланцюгового β-листів43.Додаткова нитка в IZUMO1 замінює котушку в SPACA6, яка взаємодіє з ниткою F, щоб обмежити основні водневі зв’язки в нитці.Цікавим моментом для порівняння є прогнозований заряд поверхні Ig-подібних доменів двох білків.Поверхня IZUMO1 заряджена негативніше, ніж поверхня SPACA6.Додатковий заряд розташований біля С-кінця, зверненого до мембрани сперматозоїда.У SPACA6 ті самі області були більш нейтральними або позитивно зарядженими (рис. S8e).Наприклад, гідрофобна поверхня (тонкі краї) і позитивно заряджені ямки (ширші краї) у SPACA6 негативно заряджені в IZUMO1.
Хоча взаємозв’язок і елементи вторинної структури між IZUMO1 і SPACA6 добре збереглися, структурне вирівнювання Ig-подібних доменів показало, що два домени відрізняються своєю загальною орієнтацією відносно один одного (рис. S9).Спіральний пучок IZUMO1 вигнутий навколо β-сендвіча, створюючи описану раніше форму «бумеранга» приблизно під кутом 50° від центральної осі.Навпаки, спіральний промінь у SPACA6 був нахилений приблизно на 10° у протилежному напрямку.Відмінності в цих орієнтаціях, ймовірно, пов’язані з відмінностями в шарнірній області.На первинному рівні послідовності IZUMO1 і SPACA6 мають незначну схожість послідовностей на шарнірі, за винятком залишків цистеїну, гліцину та аспарагінової кислоти.У результаті водневі зв’язки та електростатичні мережі абсолютно різні.Елементи вторинної структури β-листів спільні для IZUMO1 і SPACA6, хоча ланцюжки в IZUMO1 набагато довші, а спіраль 310 (спіраль 5) є унікальною для SPACA6.Ці відмінності призводять до різних орієнтацій доменів для двох схожих білків.
Наш пошук на сервері Dali виявив, що SPACA6 і IZUMO1 є єдиними двома експериментально визначеними структурами, які зберігаються в базі даних білків, які мають цю конкретну складку 4HB (таблиця S1).Зовсім недавно DeepMind (Alphabet/Google) розробив AlphaFold, систему на основі нейронної мережі, яка може точно передбачати тривимірні структури білків за первинними послідовностями48.Невдовзі після того, як ми розгадали структуру SPACA6, була опублікована база даних AlphaFold, яка надає прогнозні моделі структури, що охоплюють 98,5% усіх білків у протеомі людини48,49.Використовуючи нашу визначену структуру SPACA6 як модель пошуку, пошук структурної гомології моделі в протеомі людини AlphaFold виявив кандидатів із можливою структурною подібністю до SPACA6 та IZUMO1.Враховуючи неймовірну точність AlphaFold у прогнозуванні SPACA6 (рис. S10a) — особливо ектодомен 1,1 Å середньоквадратичного значення порівняно з нашою визначеною структурою (рис. S10b) — ми можемо бути впевнені, що ідентифіковані збіги SPACA6, ймовірно, точні.
Раніше PSI-BLAST шукав кластер IZUMO1 з трьома іншими білками, асоційованими зі сперматозоїдом: IZUMO2, IZUMO3 і IZUMO450.AlphaFold передбачив, що ці білки сімейства IZUMO згортаються в домен 4HB з таким же малюнком дисульфідного зв’язку, що й IZUMO1 (рис. 3a і S11), хоча в них відсутній Ig-подібний домен.Існує гіпотеза, що IZUMO2 і IZUMO3 є однобічними мембранними білками, подібними до IZUMO1, тоді як IZUMO4, здається, секретується.Функції білків IZUMO 2, 3 і 4 у злитті гамет не визначені.Відомо, що IZUMO3 відіграє роль у біогенезі акросом під час розвитку сперматозоїдів51, а білок IZUMO утворює комплекс50.Збереження білків IZUMO у ссавців, рептилій і амфібій свідчить про те, що їх потенційна функція узгоджується з функцією інших відомих білків, пов’язаних зі злиттям гамет, таких як DCST1/2, SOF1 і FIMP.
Діаграма доменної архітектури суперсімейства IST з 4HB, шарнірним і Ig-подібним доменами, виділеними помаранчевим, зеленим і синім відповідно.IZUMO4 має унікальну С-кінцеву область, яка виглядає чорною.Підтверджені та передбачувані дисульфідні зв’язки показані суцільними та пунктирними лініями відповідно.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) і TMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) відображаються в тому ж діапазоні кольорів, що й панель A. Дисульфідні зв’язки показані пурпуровим.Трансмембранні спіралі TMEM95, IZUMO2 і IZUMO3 не показані.
На відміну від білка IZUMO, інші білки SPACA (тобто SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 і SPACA9) вважаються структурно відмінними від SPACA6 (рис. S12).Лише SPACA9 має 4HB, але не очікується, що він матиме таку ж паралельно-антипаралельну орієнтацію чи такий самий дисульфідний зв’язок, як SPACA6.Тільки SPACA1 має подібний Ig-подібний домен.AlphaFold передбачає, що SPACA3, SPACA4 і SPACA5 мають зовсім іншу структуру, ніж SPACA6.Цікаво, що SPACA4, як відомо, також відіграє роль у заплідненні, але більшою мірою, ніж SPACA6, натомість полегшуючи взаємодію між сперматозоїдом і ооцитом pellucida52.
Наш пошук AlphaFold знайшов іншу відповідність для IZUMO1 і SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, єдиний специфічний для сперми трансмембранний білок, робить мишей-самців безплідними при абляції 32,33.Сперматозоїди без TMEM95 мали нормальну морфологію, рухливість і здатність проникати в оболонку оболонки і зв’язуватися з мембраною яйцеклітини, але не могли зливатися з мембраною ооцита.Попередні дослідження показали, що TMEM95 має структурну схожість з IZUMO133.Дійсно, модель AlphaFold підтвердила, що TMEM95 є 4HB з тією ж парою мотивів CXXC, що й IZUMO1 і SPACA6, і таким же додатковим дисульфідним зв’язком між спіралями 1 і 2, знайденими в SPACA6 (рис. 3a і S11).Хоча TMEM95 не має Ig-подібного домену, він має область із структурою дисульфідного зв’язку, подібну до шарнірних областей SPACA6 та IZUMO1 (рис. 3b).На момент публікації цього рукопису сервер препринтів повідомив структуру TMEM95, підтверджуючи результат AlphaFold53.TMEM95 дуже схожий на SPACA6 і IZUMO1 і еволюційно зберігся вже у амфібій (рис. 4 і S13).
Пошук PSI-BLAST використовував бази даних NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP і SOF1, щоб визначити положення цих послідовностей у дереві життя.Відстані між точками розгалуження показані не в масштабі.
Разюча загальна структурна подібність між SPACA6 і IZUMO1 свідчить про те, що вони є членами-засновниками консервативної структурної надродини, яка включає білки TMEM95 і IZUMO 2, 3 і 4.відомі члени: IZUMO1, SPACA6 і TMEM95.Оскільки лише кілька членів мають Ig-подібні домени, відмінною рисою суперродини IST є домен 4HB, який має унікальні особливості, спільні для всіх цих білків: 1) Скручений 4HB зі спіралями, розташованими в антипаралельному/паралельному чергуванні (рис. 5a), 2) пучок має трикутну поверхню, що складається з двох спіралей усередині пучка та третьої вертикальної спіралі (рис. Ключова область (рис. 5c). Відомо, що мотив CXXC, знайдений у тіоредоксиноподібних білках, функціонує як окислювально-відновний датчик 54,55,56, тоді як мотив у членах сімейства IST може бути пов’язаний з білковими дисульфід-ізомеразами, такими як ERp57, у злитті гамет.
Члени надродини IST визначаються трьома характерними ознаками домену 4HB: чотирма спіралями, що чергуються між паралельною та антипаралельною орієнтацією, ba-трикутними спіральними гранями пучка та подвійним мотивом ca CXXC, утвореним між малими молекулами.) N-кінцеві спіралі (помаранчеві) і шарнірна область β-шпилька (зелена).
Враховуючи подібність між SPACA6 та IZUMO1, була перевірена здатність першого зв’язуватися з IZUMO1 або JUNO.Інтерферометрія біошару (BLI) — це метод зв’язування на основі кінетики, який раніше використовувався для кількісної оцінки взаємодії між IZUMO1 і JUNO.Після інкубації міченого біотином датчика з IZUMO1 як приманкою з високою концентрацією аналіту JUNO було виявлено сильний сигнал (рис. S14a), що вказує на індуковану зв’язуванням зміну товщини біоматеріалу, прикріпленого до наконечника датчика.Подібні сигнали (тобто JUNO, підключений до датчика як приманка проти аналіту IZUMO1) (рис. S14b).Жодного сигналу не було виявлено, коли SPACA6 використовувався як аналіт проти сенсорного IZUMO1 або сенсорного JUNO (рис. S14a,b).Відсутність цього сигналу вказує на те, що позаклітинний домен SPACA6 не взаємодіє з позаклітинним доменом IZUMO1 або JUNO.
Оскільки аналіз BLI базується на біотинілюванні вільних залишків лізину на білку приманки, ця модифікація може запобігти зв’язуванню, якщо у взаємодії беруть участь залишки лізину.Крім того, орієнтація зв’язування відносно сенсора може створювати стеричні перешкоди, тому звичайні аналізи з випаданням також проводилися на рекомбінантних ектодоменах SPACA6, IZUMO1 та JUNO.Незважаючи на це, SPACA6 не випадало в осад із міченим His IZUMO1 або JUNO з міткою His (рис. S14c,d), що вказує на відсутність взаємодії, що відповідає тій, що спостерігалася в експериментах BLI.В якості позитивного контролю ми підтвердили взаємодію JUNO з міченим His IZUMO1 (рис. S14e і S15).
Незважаючи на структурну подібність між SPACA6 та IZUMO1, нездатність SPACA6 зв’язувати JUNO не є дивною.Поверхня IZUMO1 людини має більше 20 залишків, які взаємодіють з JUNO, включаючи залишки з кожної з трьох областей (хоча більшість із них розташовані в шарнірній області) (рис. S14f).З цих залишків лише один зберігається в SPACA6 (Glu70).У той час як багато замін залишків зберегли свої вихідні біохімічні властивості, основний залишок Arg160 в IZUMO1 був замінений на негативно заряджений Asp148 в SPACA6;попередні дослідження показали, що мутація Arg160Glu в IZUMO1 майже повністю скасовує зв’язування з JUNO43.Крім того, різниця в орієнтації домену між IZUMO1 і SPACA6 значно збільшила площу поверхні сайту зв’язування JUNO еквівалентної області на SPACA6 (рис. S14g).
Незважаючи на відому потребу в SPACA6 для злиття гамет і його схожість з IZUMO1, SPACA6, здається, не має еквівалентної функції зв’язування JUNO.Тому ми намагалися поєднати наші структурні дані з доказами важливості, наданими еволюційною біологією.Вирівнювання послідовностей гомологів SPACA6 показує збереження спільної структури за межами ссавців.Наприклад, залишки цистеїну присутні навіть у далеких споріднених земноводних (рис. 6а).Використовуючи сервер ConSurf, багаторазові дані збереження вирівнювання послідовностей 66 послідовностей були зіставлені на поверхню SPACA6.Цей тип аналізу може показати, які залишки були збережені під час еволюції білка, і може вказати, які ділянки поверхні відіграють роль у функціонуванні.
a Вирівнювання послідовності ектодоменів SPACA6 з 12 різних видів, отримане за допомогою CLUSTAL OMEGA.Згідно з аналізом ConSurf, синім кольором позначені найбільш консервативні позиції.Залишки цистеїну виділені червоним кольором.Межі доменів і елементи вторинної структури показані у верхній частині вирівнювання, де стрілки вказують на β-нитки, а хвилі вказують на спіралі.Ідентифікатори доступу NCBI, що містять послідовності: людина (Homo sapiens, NP_001303901), мандрил (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), мавпа-капуцин (Cebus mimic, XP_017359366), кінь (Equus caballus, XP_023506102), косатка (Orc inus orca3_23 XP_032_034) .), вівця (Ovis aries, XP_014955560), слон (Loxodonta africana, XP_010585293), собака (Canis lupus familyis, XP_025277208), миша (Mus musculus, NP_001156381), тасманійський диявол (Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0). 318), Качкодзьоб, 8) , 61_89 та жаба-бик (Bufo bufo, XP_040282113).Нумерація базується на людському порядку.b Представлення поверхні структури SPACA6 з 4HB угорі та Ig-подібним доменом унизу, кольори на основі оцінок збереження з сервера ConSurf.Найкраще збережені частини позначено синім кольором, помірно збережені — білим, найменш збережені — жовтим.фіолетовий цистеїн.На вставці з написами 1, 2 і 3 показано три накладки на поверхні, що демонструють високий рівень захисту. На вставці вгорі праворуч зображено малюнок 4HB (та сама колірна схема).
Структура SPACA6 має три висококонсервативні ділянки поверхні (рис. 6b).Латка 1 охоплює 4HB і шарнірну область і містить два збережених дисульфідних містка CXXC, шарнірну мережу Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (рис. S7) і три збережені зовнішні ароматичні залишки (Phe31, Tyr73, Phe137)).ширший обідок Ig-подібного домену (рис. S6e), який представляє кілька позитивно заряджених залишків на поверхні сперми.Цікаво, що цей пластир містить епітоп антитіла, який, як було раніше показано, перешкоджає функціонуванню SPACA6 30.Область 3 охоплює шарнір і одну сторону Ig-подібного домену;ця область містить консервативні проліни (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) і спрямовані назовні полярні/заряджені залишки.Дивно, але більшість залишків на поверхні 4HB дуже варіабельні (рис. 6b), хоча складка зберігається в усьому гомолозі SPACA6 (на що вказує консерватизм ядра гідрофобного пучка) і за межами надродини IST.
Хоча це найменша область у SPACA6 з найменшою кількістю елементів вторинної структури, які можна виявити, багато залишків шарнірної області (включаючи область 3) є висококонсервативними серед гомологів SPACA6, що може вказувати на те, що орієнтація спірального пучка та β-сендвіча відіграє певну роль.як консерватор.Однак, незважаючи на великі водневі зв’язки та електростатичні мережі в шарнірній області SPACA6 та IZUMO1, докази внутрішньої гнучкості можна побачити у вирівнюванні кількох дозволених структур IZUMO137,43,44.Вирівнювання окремих доменів добре перекривалося, але орієнтація доменів відносно один одного змінювалася від 50° до 70° від центральної осі (рис. S16).Щоб зрозуміти конформаційну динаміку SPACA6 у розчині, було проведено експерименти SAXS (рис. S17a,b).Ab initio реконструкція ектодомену SPACA6 відповідала стрижневій кристалічній структурі (рис. S18), хоча графік Краткі показав певний ступінь гнучкості (рис. S17b).Ця конформація контрастує з IZUMO1, в якому незв'язаний білок приймає форму бумеранга як в решітці, так і в розчині43.
Для конкретної ідентифікації гнучкої області була проведена мас-спектроскопія воднево-дейтерієвого обміну (H-DXMS) на SPACA6 та порівняна з даними, отриманими раніше на IZUMO143 (рис. 7a,b).SPACA6 явно більш гнучкий, ніж IZUMO1, про що свідчить вищий обмін дейтерієм у всій структурі після 100 000 с обміну.В обох структурах С-кінцева частина шарнірної області демонструє високий рівень обміну, що, ймовірно, дозволяє обмежене обертання 4HB та Ig-подібних доменів відносно один одного.Цікаво, що C-кінцева частина шарніра SPACA6, що складається із залишку 147CDLPLDCP154, є висококонсервативною областю 3 (рис. 6b), що, можливо, вказує на те, що міждоменна гнучкість є еволюційно збереженою особливістю SPACA6.Згідно з аналізом гнучкості, дані термічного плавлення CD показали, що SPACA6 (Tm = 51,2 °C) менш стабільний, ніж IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) (рис. S1e і S19).
a H-DXMS зображення SPACA6 і b IZUMO1.Відсоток обміну дейтерію визначали в зазначені моменти часу.Рівні воднево-дейтерієвого обміну позначаються кольором на градієнтній шкалі від синього (10%) до червоного (90%).Чорні ящики представляють області високого обміну.Межі 4HB, шарнірного та Ig-подібного домену, що спостерігаються в кристалічній структурі, показані над первинною послідовністю.Рівні обміну дейтерію за 10 с, 1000 с і 100 000 с були нанесені на смужкову діаграму, накладену на прозорі молекулярні поверхні SPACA6 і IZUMO1.Частини структур з рівнем обміну дейтерію нижче 50% пофарбовані в білий колір.Ділянки вище 50% обміну H-DXMS пофарбовані в градієнтну шкалу.
Використання CRISPR/Cas9 і генетичних стратегій нокауту гена миші призвело до виявлення кількох факторів, важливих для зв’язування та злиття сперматозоїдів і яйцеклітин.Окрім добре охарактеризованої взаємодії IZUMO1-JUNO та структури CD9, більшість білків, пов’язаних зі злиттям гамет, залишаються структурно та функціонально загадковими.Біофізична та структурна характеристика SPACA6 є ще однією частиною молекулярної головоломки адгезії/злиття під час запліднення.
SPACA6 та інші члени надродини IST, здається, дуже консервативні у ссавців, а також у окремих птахів, рептилій і амфібій;фактично вважається, що SPACA6 необхідний навіть для запліднення рибок даніо 59. Цей розподіл подібний до інших відомих білків, асоційованих зі злиттям гамет, таких як DCST134, DCST234, FIMP31 і SOF132, що свідчить про те, що ці фактори є дефіцитними за HAP2 (також відомі як GCS1) білки, які відповідають за каталітичну активність багатьох протистів., рослини та членистоногі.Запліднені злиті білки 60, 61. Незважаючи на сильну структурну подібність між SPACA6 та IZUMO1, нокаут генів, що кодують будь-який із цих білків, призвів до безпліддя у самців мишей, що вказує на те, що їхні функції у злитті гамет не дублюються..У більш широкому сенсі жоден із відомих білків сперми, необхідних для фази адгезії злиття, не є зайвим.
Залишається відкритим питання, чи SPACA6 (та інші члени суперсімейства IST) беруть участь у міжгаметичних з’єднаннях, утворюють внутрішньогаметичні мережі для залучення важливих білків до точок злиття, чи, можливо, навіть діють як невловимі фузогени.Дослідження спільної імунопреципітації в клітинах HEK293T виявили взаємодію між повнорозмірним IZUMO1 і SPACA632.Однак наші рекомбінантні ектодомени не взаємодіяли in vitro, що свідчить про те, що взаємодії, спостережені у Noda et al.обидва були видалені в конструкції (зверніть увагу на цитоплазматичний хвіст IZUMO1, який, як було показано, непотрібний для запліднення62).Крім того, IZUMO1 та/або SPACA6 можуть потребувати специфічних зв’язувальних середовищ, які ми не відтворюємо in vitro, наприклад, фізіологічно специфічних конформацій або молекулярних комплексів, що містять інші білки (відомі або ще не виявлені).Хоча вважається, що ектодомен IZUMO1 опосередковує прикріплення сперматозоїдів до яйцеклітини в перивітеліновому просторі, мета ектодомену SPACA6 незрозуміла.
Структура SPACA6 виявляє кілька консервативних поверхонь, які можуть брати участь у білок-білкових взаємодіях.Збережена частина шарнірної області, яка безпосередньо примикає до мотиву CXXC (позначена патчем 1 вище), має кілька звернених назовні ароматичних залишків, які часто пов’язані з гідрофобними та π-стекінговими взаємодіями між біомолекулами.Широкі сторони Ig-подібного домену (область 2) утворюють позитивно заряджену борозенку з висококонсервативними залишками Arg і His, і антитіла проти цієї області раніше використовувалися для блокування злиття гамет 30 .Антитіло розпізнає лінійний епітоп 212RIRPAQLTHRGTFS225, який містить три з шести залишків аргініну та висококонсервативний His220.Незрозуміло, чи дисфункція спричинена блокуванням цих специфічних залишків чи цілої області.Розташування цього розриву поблизу С-кінця β-сендвіча вказує на цис-взаємодії з сусідніми білками сперми, але не з білками ооцитів.Крім того, збереження дуже гнучкого багатого проліном клубка (місце 3) всередині шарніра може бути місцем білок-білкової взаємодії або, що більш імовірно, вказувати на збереження гнучкості між двома доменами.Стать важлива для невідомої ролі SPACA6.злиття гамет.
SPACA6 має властивості білків міжклітинної адгезії, включаючи Ig-подібні β-сендвічі.Багато адгезивних білків (наприклад, кадгерини, інтегрини, адгезини та IZUMO1) мають один або більше β-сендвіч-доменів, які поширюють білки від клітинної мембрани до їхніх мішеней навколишнього середовища63,64,65.Ig-подібний домен SPACA6 також містить мотив, який зазвичай зустрічається в β-сендвічах адгезії та когезії: дублети паралельних ниток на кінцях β-сендвічів, відомі як механічні затискачі66.Вважається, що цей мотив підвищує стійкість до зсувних сил, що є цінним для білків, які беруть участь у міжклітинних взаємодіях.Однак, незважаючи на таку схожість з адгезинами, наразі немає доказів того, що SPACA6 взаємодіє з яєчними білками.Ектодомен SPACA6 не здатний зв’язуватися з JUNO, а клітини HEK293T, що експресують SPACA6, як показано тут, навряд чи взаємодіють з ооцитами без зони 32.Якщо SPACA6 встановлює міжгаметичні зв’язки, ці взаємодії можуть вимагати посттрансляційних модифікацій або стабілізації іншими білками сперми.На підтримку останньої гіпотези сперматозоїди з дефіцитом IZUMO1 зв’язуються з ооцитами, демонструючи, що молекули, відмінні від IZUMO1, беруть участь у етапі адгезії гамет 27.
Багато вірусних, клітинних і еволюційних злитих білків мають властивості, які передбачають їхню функцію фузогенів.Наприклад, вірусні злиті глікопротеїни (класи I, II і III) мають гідрофобний злитий пептид або петлю на кінці білка, який вставляється в мембрану господаря.Карта гідрофільності IZUMO143 і структура (визначена та передбачена) надродини IST не показали очевидного гідрофобного злитого пептиду.Таким чином, якщо будь-які білки в надродині IST функціонують як фузогени, вони роблять це способом, відмінним від інших відомих прикладів.
На завершення функції членів надродини білків IST, пов’язаних із злиттям гамет, залишаються спокусливою загадкою.Наша охарактеризована рекомбінантна молекула SPACA6 та її чітка структура дадуть зрозуміти взаємозв’язки між цими спільними структурами та їх роль у прикріпленні та злитті гамет.
Послідовність ДНК, що відповідає передбаченому ектодомену SPACA6 людини (номер доступу NCBI NP_001303901.1; залишки 27–246), була оптимізована за кодоном для експресії в клітинах Drosophila melanogaster S2 і синтезована як фрагмент гена з послідовністю, що кодує Kozak (Eurofins Genomics)., сигнал секреції BiP і відповідні 5'- і 3'-кінці для незалежного від лігування клонування цього гена в вектор експресії pMT на основі промотору металотіонеїну, модифікованого для селекції пуроміцином (pMT-puro).Вектор pMT-puro кодує сайт розщеплення тромбіну, за яким слідує С-кінцева мітка 10x-His (рис. S2).
Стабільну трансфекцію вектора SPACA6 pMT-puro в клітини D. melanogaster S2 (Gibco) проводили подібно до протоколу, який використовується для IZUMO1 і JUNO43.Клітини S2 розморожували та вирощували в середовищі Шнайдера (Gibco), доповненому кінцевою концентрацією 10% (об./об.) термоінактивованої фетальної телячої сироватки (Gibco) та 1X протигрибкового антибіотика (Gibco).Клітини раннього пасажу (3,0 × 106 клітин) поміщали в окремі лунки 6-лункових планшетів (Corning).Після 24 годин інкубації при 27°C клітини трансфікували сумішшю 2 мг вектора SPACA6 pMT-puro та трансфекційного реагенту Effectene (Qiagen) згідно з протоколом виробника.Трансфіковані клітини інкубували протягом 72 годин, а потім збирали з 6 мг/мл пуроміцину.Потім клітини виділяли з повного середовища Шнайдера і поміщали в безсироваткове середовище Insect-XPRESS (Lonza) для великомасштабного виробництва білка.1 л культури клітин S2 вирощували до 8–10 × 106 мл-1 клітин у 2 л вентильованій плоскодонній поліпропіленовій колбі Ерленмейєра, а потім стерилізували кінцевою концентрацією 500 мкМ CuSO4 (Millipore Sigma) і стерильно фільтрували.індукований.Індуковані культури інкубували при 27°C при 120 об/хв протягом чотирьох днів.
Кондиціоноване середовище, що містить SPACA6, виділяли центрифугуванням при 5660×g при 4°C з подальшим використанням системи фільтрації тангенціального потоку Centramate (Pall Corp) з мембраною MWCO 10 кДа.Нанесіть концентроване середовище, що містить SPACA6, на колонку з агарозною смолою Ni-NTA (Qiagen) на 2 мл.Смолу Ni-NTA промивали 10 об’ємами колонки (CV) буфера A, а потім додавали 1 CV буфера A, щоб отримати кінцеву концентрацію імідазолу 50 мМ.SPACA6 елюювали 10 мл буфера А з додаванням імідазолу до кінцевої концентрації 500 мМ.Тромбін рестрикційного класу (Millipore Sigma) додавали безпосередньо в діалізну трубку (MWCO 12-14 кДа) по 1 одиниці на мг SPACA6 проти 1 л 10 мМ Трис-HCl, pH 7,5 і 150 мМ NaCl (буфер B) для діалізу.) при 4°C протягом 48 годин.Розщеплений тромбіном SPACA6 потім розбавляли втричі, щоб зменшити концентрацію солі, і завантажували на 1 мл катіонообмінну колонку MonoS 5/50 GL (Cytiva/GE), урівноважену 10 мМ Tris-HCl, pH 7,5.Катіонообмінник промивали 3 ОК 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5, потім SPACA6 элюировали лінійним градієнтом від 0 до 500 мМ NaCl в 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5 протягом 25 ОК.Після іонообмінної хроматографії SPACA6 концентрували до 1 мл і елюювали ізократично з колонки ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad), урівноваженої буфером B. Відповідно до хроматограми об’єднайте та концентруйте фракції, що містять SPACA6.Чистоту контролювали за допомогою електрофорезу, забарвленого Кумасі, на 16% SDS-поліакриламідному гелі.Концентрацію білка кількісно визначали за поглинанням при 280 нм з використанням закону Бір-Ламберта та теоретичного молярного коефіцієнта екстинкції.
Очищений SPACA6 діалізували протягом ночі проти 10 мМ фосфату натрію, pH 7,4 і 150 мМ NaF і розбавляли до 0,16 мг/мл перед аналізом за допомогою CD-спектроскопії.Спектральне сканування CD з довжиною хвилі від 185 до 260 нм збирали на спектрополяриметрі Jasco J-1500 з використанням кварцових кювет з довжиною оптичного шляху 1 мм (Helma) при 25 °C зі швидкістю 50 нм/хв.Спектри CD були скориговані за базовою лінією, усереднені за 10 зборів і перетворені в середню залишкову еліптичність (θMRE) у градусах см2/дмоль:
де MW - молекулярна маса кожного зразка в Да;N – кількість амінокислот;θ – еліптичність у міліградусах;d відповідає довжині оптичного шляху в см;концентрація білка в од.