310 10*1 мм спіральна труба з нержавіючої сталі хімічний компонент, N-кінцеві домени спидроина утворюють гідрогелі на основі амілоїдних фібрил і забезпечують платформу для іммобілізації білка.

Дякуємо, що відвідали Nature.com.Ви використовуєте версію браузера з обмеженою підтримкою CSS.Для найкращої роботи радимо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer).Крім того, щоб забезпечити постійну підтримку, ми показуємо сайт без стилів і JavaScript.
Повзунки, що показують три статті на слайді.Використовуйте кнопки «Назад» і «Далі» для переходу між слайдами або кнопки керування слайдами в кінці для переходу між слайдами.

Специфікація

310 постачальників спіральних труб із нержавіючої сталі 10*1 мм

Хімічний склад

Механічні властивості

Рекомбінантні білки шовку павука (білки шовку павука) мають багато потенційних застосувань у розробці нових біоматеріалів, але їх мультимодальний характер і схильність до агрегації ускладнюють їх отримання та легкість у використанні.Тут ми повідомляємо, що рекомбінантні мініатюрні білки спидроїну і, що важливо, сам N-кінцевий домен (NT) швидко утворюють самопідтримувані та прозорі гідрогелі при 37 °C.злиті білки, що складаються з NT і зеленого флуоресцентного білка або пуринової нуклеозидфосфорилази, утворюють повністю функціональні злиті білки.Гідрогелі.Наші результати показують, що рекомбінантні NT і злиті білки забезпечують високий вихід експресії та наділяють гідрогелі привабливими властивостями, такими як прозорість, гелеутворення без зшивання та пряма іммобілізація активних білків при високій щільності.
Павуки мають аж сім різних наборів шовкових залоз, кожна з яких виробляє певний тип шовку.Усі сім видів шовку складаються з білків шовку павуків (спідроїнів) довжиною приблизно 6000 залишків і містять велику центральну область повторів, оточену сферичними N- і C-кінцевими доменами (NT і CT)1,2.Найбільш вивчений тип шовку, первинна ампула, виробляється первинною ампулною залозою.У цій залозі моношар епітеліальних клітин синтезує білки спідроїну та секретує їх у просвіт залози, де вони присутні в розчинній формі (допінг) у надзвичайно високих концентраціях (30–50% w/v)3,4.Організація та конформація основних ампулярних білків спидроїну в залозі обговорювалася, але більшість експериментальних доказів вказує на наявність загалом спіральної та/або випадкової спіральної конформації та міцелярних або пластинчастих структур5,6,7,8,9,10.У той час як повторювані домени регулюють механічні властивості шовкових волокон, утворюючи β-листові нанокристали та аморфні структури11,12,13,14,15, кінцеві домени регулюють шовкові волокна у відповідь на зміну умов уздовж шовкової залози16,17,18.Контролюючи утворення шовку, 19. Кінцеві домени є еволюційно консервативними, і їх функція може бути спільною для всіх білків спідроїну 2,20,21.Під час проходження через залозу рН спідроїну знижується приблизно з 7,6 до < 5,716 і підвищується при зсуві та розтягуванні, опосередкованих рухом через поступово звужується протоку.У розчині CT є α-спіральним конститутивним паралельним димером17, але у відповідь на низький рН і зсувні сили CT розгортається та перемикає β-шари16, 17, можливо, запускаючи β-шари в повторюваних областях Convert 16. NT є ​​мономерними під умови, що відображають умови в просвіті залози та опосередковують розчинність спідроїну, але при зниженому рН протонування ряду бічних ланцюгів карбонової кислоти призводить до димеризації NT з pKa приблизно 6,5, тим самим стабілізуючи NT і фіксуючи спідроїн у великих кількості.мережі16,18.Таким чином, NT відіграє ключову роль у формуванні ниток, перетворюючись із мономеру в покритті на димер у волокні23,24,25.NT залишається добре розчинним і спіральним за всіх умов, вивчених на сьогоднішній день 16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, що надихнуло його розробку як мітки, що підвищує розчинність, для виробництва гетерологічних білків.
Рекомбінантний міні-білок шовку павука, що складається з однієї NT, однієї короткої повторюваної ділянки, одного CT і мітки His6 (His-NT2RepCT) для очищення, так само розчинний у водному буфері, як нативний протеїн шовку павука, і імітує важливі властивості природного шовку. .покриття 25.31.His-NT2RepCT можна прясти в безперервні волокна за допомогою біоміметичної машини, в якій розчинне покриття pH 8 екструдується у водяну баню pH 525, 32, 33, 34, 35.Ферментація в біореакторі E. coli, що експресує His-NT2RepCT, і подальша додаткова обробка призвели до виходу >14 г/л після очищення.Високий вихід, висока розчинність і адекватна реакція His-NT2RepCT на кислі умови приписуються NT23, 25, 34.
Тут ми повідомляємо про швидке утворення прозорих гідрогелів з рекомбінантних білків спидроїну, включаючи лише NT, шляхом інкубації розчину білка при 37 ° C.Використовуючи флуоресценцію тіофлавіну Т (ThT), інфрачервону спектроскопію з перетворенням Фур’є (FTIR), спектроскопію ядерного магнітного резонансу (ЯМР) і трансмісійну електронну мікроскопію (ТЕМ), ми виявили, що білки NT і мікропавуків зазнають структурної трансформації в β-пластини та амілоїдоподібні фібрили. коли утворюються гелі.Крім того, злиті білки NT і зелений флуоресцентний білок (GFP) або пуриннуклеозидфосфорилаза (PNP) утворюють гідрогелі з повністю функціональними фрагментами злиття.Висока продуктивність експресії в гетерологічних господарях у поєднанні зі швидким утворенням гідрогелів у фізіологічних умовах відкриває можливість економічно ефективного виробництва гідрогелів зі спеціально розробленими функціями.
На відміну від більшості зареєстрованих рекомбінантних білків спідроїну36, His-NT2RepCT стабільний у буфері Tris-HCl при рН 8 і може бути сконцентрований до 500 мг/мл без утворення осаду25.Таким чином, ми були здивовані, виявивши, що цей білок швидко утворює оптично прозорі самопідтримуючі гідрогелі при інкубації при 37°C (рис. 1b-d).Подальші дослідження показали, що гелеутворення His-NT2RepCT відбувалося в широкому діапазоні концентрацій білка (10–300 мг/мл) і що ця концентрація обернено корелювала з часом гелеутворення (рис. 1c і додаткова рис. 1).Щоб з’ясувати, які частини His-NT2RepCT опосередковують утворення гідрогелю, ми дослідили кожен домен окремо та в різних комбінаціях за допомогою аналізу інверсії колби (рис. 1a, b).Усі протестовані фракції рекомбінантного спідроїну утворювали гелі (при концентрації білка 300 мг/мл) менш ніж за 1 годину, за винятком осадженого 2Rep (рис. 1b).Це свідчить про те, що NT і CT поодинці, у комбінації або пов’язані з повторами, можуть утворювати гель при 37°C і що мітка His6 не впливає на цей процес суттєво.Враховуючи загальне уявлення про те, що NT є ​​високорозчинним і стабільним білком, і що попередні звіти про рекомбінантні гідрогелі спидроїну приписували ефекти гелеутворення конформаційним змінам у повторюваних областях та/або CT, сама NT могла.Відкриття гелеутворення було несподіваним.Додаткова таблиця 1) 37, 38, 39. Примітно, що NT вже гелеобразувався протягом 10 хвилин у концентрації ≥ 300 мг/мл (рис. 1c).Експерименти з перевертанням флакона з різними концентраціями NT показали, що при >50 мг/мл розчин NT гелеобразував швидше, ніж His-NT2RepCT при відповідній концентрації (маса/об’єм, рис. 1c).
Схематичне зображення різних конструкцій спидроїну, досліджених у цій роботі.b Час гелеутворення при 37 °C для різних рекомбінантних білків спідроїну (300 мг/мл), перевірений шляхом перевертання флакона.КТ-гель відразу без інкубації (<300 мг/мл), 2 повторних осаду (300 мг/мл, масштаб 5 мм).c Час гелеутворення His-NT2RepCT і NT при вказаних концентраціях білка при 37°C.d Фотографії гідрогелів His-NT2RepCT та NT із зображенням павука та літерою «NT», надрукованими під ними, відповідно (обидва 200 мг/мл, шкала 5 мм).
Гідрогелі, утворені різними рекомбінантними білками спідроїну, мають дещо різні кольори, а спостереження неозброєним оком демонструє різний ступінь прозорості (рис. 1b).Гелі NT надзвичайно прозорі, тоді як інші гелі стають непрозорими.Гелі His-NT2RepCT і NT, відлиті в циліндричні трубки, можна було вилучити з форми неушкодженими (рис. 1d).
Щоб перевірити, чи гелеподібні покриття з натурального павутинного шовку за умов, які тепер викликають гелеутворення рекомбінантних білків спідроїну, було зібрано покриття з великої залози ампули шведського мостового павука (Larinioides sclopetarius).Покриття зберігалися в 20 мМ трис-HCl буфері при 50 мг/мл (на основі виміряної сухої ваги), але гелеутворення не спостерігалося протягом 21 дня інкубації при 37 °C (додаткова фігура 2а).
Для кількісного визначення цих гелів можна використовувати реологічні вимірювання для вивчення процесу гелеутворення та визначення загальних механічних властивостей.Зокрема, моніторинг модуля збереження (пружності) при підвищених температурах може надати інформацію про температуру гелеутворення, а також про в’язкопружні властивості покриття.Експерименти з підвищенням температури (з використанням 1°C/хв при 25-45°C, засновані на попередніх дослідженнях з використанням базових розчинів натурального шовку)40,41 показали, що модулі зберігання розчинів His-NT2RepCT і NT збільшуються з підвищенням температури.було збільшено (рис. 2 і додатковий рис. 3).Примітно, що модуль NT почав рости при нижчій температурі порівняно з His-NT2RepCT, що відповідає швидшому часу утворення гелю, який спостерігався, коли NT безпосередньо інкубували з His-NT2RepCT при 37°C (рис. 1).Після подальшого зниження температури модуль зберігання не повернувся до нижчих значень і залишився вище модуля втрат (див. Додатковий рис. 3), що вказує на термічно незворотне стабільне гелеутворення.Після гелеутворення кінцевий модуль пружності коливався від 15 до 330 кПа для гідрогелів His-NT2RepCT при концентрації 100–500 мг/мл, а кінцевий модуль пружності для гідрогелів NT (100–500 мг/мл) коливався від 2 до 1400 кПа (Рис. , 2 і повні дані нахилу) див. Додатковий рис. 3).
a Зміна температури під час вимірювання His-NT2RepCT (300 мг/мл) і b NT (300 мг/мл) зі струшуванням.Стрілки вказують температурну тенденцію, а більш світле затінення даних модуля зберігання зображує тестування при нижчих значеннях крутного моменту для приладу, ніж зазначено виробником, що є причиною підвищеного шуму.c Накопичення His-NT2RepCT і NT на кінцевому модулі після підвищення температури (100, 300 і 500 мг/мл).Усі показання модуля знімаються на частоті 0,1 Гц.
Як потенційний метод дослідження конформаційних змін, пов’язаних із гелеутворенням, ми записали спектри FTIR His-NT2RepCT і NT до та після гелеутворення при 37°C (рис. 3a,b).Як і очікувалося, спектри розчинів His-NT2RepCT і NT відповідали білкам, що демонструють вторинну структуру α-спіралі/випадкової спіралі з вираженою смугою при 1645 см-1.Для обох гідрогелів гелеутворення призвело до утворення двох рукавів у середній I смузі приблизно при 1617 см-1 і 1695 см-1 (рис. 3a, b), що вказує на утворення антипаралельних β-листових структур.Ці зміни також можна чітко побачити у відповідній другій похідній та різницевих спектрах гелеутворення (додатковий рис. 4b).Дві смуги β-шару NT були більш вираженими, ніж у His-NT2RepCT, що вказує на те, що загальний вміст смуг β-шару в гідрогелі NT був вищим, ніж у гідрогелю NT2RepCT.
a спектри поглинання FTIR His-NT2RepCT і b NT (обидва 500 мг/мл) до (розчин) і після (гель) інкубації при 37°C.c ТЕМ-зображення ресуспендованих 50 мг/мл гелів NT2RepCT і d NT.Масштабна шкала 200 нм.e Діаметри волокон гідрогелів His-NT2RepCT та NT.n = 100 виміряних фібрил, p < 0,0001.Смуги помилок показують стандартне відхилення.Центр смужок помилок є середнім.Для статистичного аналізу використовувався непарний t-тест (двосторонній).f Флуоресценція ThT різних рекомбінантних білків спідроїну (100 мг/мл) при 37 °C без струшування.g Експерименти з інокуляції NT (100 мг/мл) із 100 мг/мл гелю NT з 0%, 5%, 10% і 20% насіння.
Аналіз гелю за допомогою трансмісійної електронної мікроскопії (ТЕМ) показав, що гідрогель складається з амілоїдоподібних фібрил (рис. 3c, 3d).NT-утворені фібрили були подовженими (5–12 нм у діаметрі) і нерозгалуженими, тоді як фібрили His-NT2RepCT були коротшими за довжиною та значно ширшими за діаметром (7–16 нм) (рис. 3e).Ці результати дозволили нам прослідкувати кінетику фіброзу за допомогою аналізу на тіофлавін Т (ThT).Для всіх рекомбінантних білків спідроїну флуоресцентний сигнал збільшився, коли зразки інкубували при 37 °C (рис. 3f, додаткова рис. 5a).Згідно з цим висновком, мікроскопічне дослідження NT і His-NT2RepCT в умовах гелеутворення виявило рівномірне збільшення флуоресценції ThT без помітного локального накопичення ThT-позитивних агрегатів (додаткова рис. 5b, c).Утворення ThT-позитивних фібрил не супроводжувалося збільшенням каламутності NT і His-NTCT (додатковий рис. 5d), що означає, що мережа фібрил у гелі може утворюватися без шкоди для прозорості гелю.Посів шляхом додавання невеликих кількостей попередньо сформованих фібрил може значно прискорити утворення фібрил деяких амілоїдів42,43,44, але додавання 5%, 10% або 20% (мас./мас.) NT до розчину гідрокоагулянтів NT.ефект посіву (рис. 3g).Можливо, це пов'язано з тим, що фібрили в гідрогелі відносно фіксовані і не можуть використовуватися як затравки.
Несподівана поведінка рекомбінантних білків спідроїну при високих температурах спонукала до подальших досліджень спектроскопії ядерного магнітного резонансу (ЯМР) для виявлення конформаційних змін, пов'язаних з утворенням гелю.ЯМР-спектри розчинів His-NT2RepCT, записані з часом при 37°C, показали, що CT все ще був частково згорнутим, тоді як сигнали NT і 2Rep зникли (рис. 4а), що свідчить про те, що головним чином NT і 2Rep частково контролювали утворення His- Гідрогель NT2RepCT.Сигнал КТ також був ослаблений до 20% від його початкової інтенсивності, що свідчить про те, що КТ також в основному фіксований і включений у структуру гідрогелю.Для меншої частини CT, яка є такою ж рухливою, як і в попередньо інкубованому зразку, і, таким чином, спостерігається за допомогою ЯМР розчину, у спектрах відсутні сигнали для перших 10 структурованих залишків, можливо, через складну іммобілізацію приєднаної частини His-NT2Rep.Спектри ЯМР -стану гідрогелів -NT2RepCT виявили переважну присутність α-спіралей і β-шарів і, меншою мірою, випадкову конформацію клубка (рис. 4b).Аналіз хімічного зсуву залишків метіоніну, присутніх лише в NT, показав, що цей домен був перетворений на β-пластову структуру.Залежні від часу спектри NT у розчині показали рівномірне зменшення інтенсивності сигналу (рис. 4c), а твердотільний ЯМР гідрогелів NT показав, що більшість залишків NT були перетворені на β-пластові структури (рис. 4d).Конформацію 2Rep неможливо визначити окремо через його тенденцію до агрегації.Однак ЯМР-спектри твердого тіла гідрогелів NTCT і His-NT2RepCT виглядали дуже схожими (рис. 4b; додаткова рис. 6b), що свідчить про те, що 2Rep незначно вносить вклад у структурну частину гідрогелю His-NT2RepCT.Було виявлено, що для гідрогелів CT існують α-спіралі, β-листи та випадкові спіральні вторинні структури (додатковий рис. 6d).Це свідчить про те, що деякі частини КТ залишаються α-спіралями, тоді як інші стають β-листами.Таким чином, результати ЯМР-спектроскопії свідчать про те, що NT важливий для утворення гідрогелю, а також перетворюється в конформацію β-листа при злитті з 2Rep і CT.У відповідності з цим нещодавно ми виявили, що амілоїдні просторові блискавки, ймовірно, утворюються у всіх п’яти спіралях домену NT, і алгоритм Waltz передбачив амілоїдогенну область у спіралі 1 (рис. 4e).
2D спектри 15N-HSQC 10 мг/мл розчину His-NT2RepCT до (синій) і через 19 годин після інкубації (червоний) при 37°C.Індивідуальні перехресні піки в червоному спектрі та F24, G136, polyA в синьому спектрі позначаються однолітерними символами амінокислот і номерами залишків.На вставках показано залежність інтенсивності сигналу від часу для вибраних залишків з доменів NT, 2Rep і CT.b Твердотільні радіочастотні (RFDR) спектри гідрогелів His-NT2RepCT.Кореляції залишків Cα/Cβ, що спостерігаються в спектрах RFDR, визначали шляхом порівняння з модельними хімічними зрушеннями пептидів і значеннями, отриманими зі статистики82,83 та їх вторинними структурами.SSB – обертова бічна смуга.c Одновимірні спектри розчину 15N-HSQC 10 мг/мл NT під час інкубації при 37 °C протягом 36 годин.На вставці показано залежність об’ємної інтенсивності від часу.d Спектри RFDR твердого тіла гідрогелів NT.Вказано кореляції залишків Cα/Cβ та їх вторинних структур, що спостерігаються в спектрах RFDR.e На основі профілю схильності до фібриляції NT45.79 з бази даних Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Енергія Розетти вікна просторового зсуву блискавки гексапептиду показана в ккал/моль.Червоні смужки позначають гексапептиди з високою схильністю до фіброзу (енергія Розетти нижче -23 ккал/моль; нижче пунктирної лінії).Зелені смужки вказують на фрагменти з енергією Розетти вище порогової величини, і тому менш імовірно, що вони утворюють стеричні блискавки.Фрагменти, що містять пролін, були виключені з аналізу (без колонок).Квадрати позначають ділянки амілоїдозу, передбачені алгоритмом Waltz81 (https://waltz.switchlab.org).Послідовність амінокислотних залишків NT знаходиться вгорі, а типи залишків, знайдених у β-вторинній структурі (визначених твердотільною ЯМР-спектроскопією), показані червоним кольором.Положення п'яти α-спіралей NT позначено як (H1-H5)28.
При pH <6,5 HT димеризується, будучи стійким до денатурації, спричиненої нагріванням або сечовиною18.Щоб з’ясувати, як димеризація та стабільність NT впливають на гелеутворення, розчини, що містять 100 мг/мл NT, контролювали при pH 8, 7 та 6 за допомогою тесту на перевертання флакона.Зразки NT, інкубовані при рН 8 і 7, утворилися в гель через 30 хвилин при 37 °C, але гель з рН 8 залишався прозорим, тоді як гель з рН 7 демонстрував видимий осад (рис. 5а).Навпаки, розчин, що містить ГТ при pH 6, не утворював гель, і через 20 хвилин при 37°C можна було побачити великий осад.Це свідчить про те, що самі димери та/або їх вища стабільність порівняно з мономерами запобігають гелеутворенню.Утворення осаду для NT при рН 7 і 6 не очікувалося, оскільки повідомлялося, що NT розчинна при 200 мг/мл27, легко повторно згортається після теплової денатурації, а також зберігає α-спіраль при нижчих значеннях рН 18. Ймовірним поясненням цих розбіжностей є те, що експерименти, про які повідомлялося раніше, проводилися при кімнатній температурі або нижче, або при відносно низьких концентраціях білка16,18,19.
Тест перевертання флакону NT (100 мг/мл) при рН 8, 7, 6 і 154 мМ NaCl (рН 8) після інкубації при 37°C.b Спектри NT CD з і без 154 мМ NaF і 154 мМ NaCl відповідно.Молярна еліптичність при 222 нм перетворюється на частку природних складок.c Інверсійний аналіз NT (100 мг/мл) NT* (37 °C і 60 °C), NTA72R (37 °C) і His-NT-L6 (37 °C і 60 °C).d Спектри CD NT мутантів NT*, NTA72R і His-NT-L6.Молярна еліптичність при 222 нм перетворюється на частку природних складок.e Тест інверсії NTFlSp, NTMiSp і зниженого NTMiSp (100 мг/мл).Масштаб 5 мм.f CD спектри NT, NTFlSp, NTMiSp та відновленого NTMiSp.Молярна еліптичність при 222 нм перетворюється на частку природних складок.Повні спектри NT при 25 °C і 95 °C показані на додатковому малюнку 8.
Фізіологічна концентрація солі визначає електростатичну взаємодію між субодиницями NT і димеризацію перенесення NT до нижчого pH18.Ми виявили, що присутність 154 мМ NaCl і NaF справді пригнічує гелеутворення відповідно (рис. 5a, b; додаткова рис. 2b) і що ці солі підвищують термічну стабільність мономерів NT (рис. 5b, додаткова рис. 8) .Це також свідчить про те, що підвищення стабільності, а не димеризація, запобігає утворенню гелю.
Для подальшого вивчення ролі димеризації та стабільності білків у гелеутворенні ми використали два мутанти, NT* та NTA72R, які також залишаються мономерними при низькому рН 28,30.NT* — це мутант із подвійною реверсією заряду, у якому видимий диполярний розподіл заряду мономеру вирівнюється, що запобігає дімеризації та різко підвищує стабільність мономеру.NTA72R є зарядженим диполем, але Arg-заміщений Ala розташований на межі димеру, тому мутації перешкоджають взаємодії субодиниць, необхідних для димеризації.Після інкубації при 37°C NT* не утворював гідрогель, тоді як NTA72R утворював непрозорий гель протягом 15 хвилин (рис. 5c).Оскільки і NT*, і NTA72R не можуть димеризуватися, але відрізняються стабільністю мономеру (рис. 5d), ці результати переконливо свідчать про те, що висока термодинамічна стабільність запобігає гелеутворенню NT.Це також підтверджується тим фактом, що HT* утворює гель, коли він нестабільний при високій температурі (через 8 хв при 60°C; рис. 5c).Раніше було показано, що високий вміст метіоніну в NT розріджує його природне згортання і що шість замінників Met на Leu (тут згадуються як His-NT-L6) сильно стабілізують мономер NT46.Виходячи з припущення, що для утворення гелю NT необхідна структурна гнучкість, ми виявили, що стабільний мутант His-NT-L6 не гелеутворювався при 37 °C (рис. 5c, d).Проте His-NT-L6 також утворював гель при інкубації при 60°С протягом 60 хв (рис. 5в).
Здатність NT перетворюватися на β-пластові структури та утворювати гідрогелі, мабуть, застосовується до деяких, але не до всіх доменів NT спидроїну.NT з різних типів шовку та видів павуків, Trichonephila clavipes (NTFlSp), утворювали гелі, незважаючи на відносно низький вміст метіоніну та високу термостабільність (рис. 5e, f та додаткова таблиця 2).Навпаки, NT з невеликого ампулярного білка спидроина з Araneus ventricosus (NTMiSp) з низькою термічною стабільністю та високим вмістом метіоніну не утворює гідрогелів (додаткова таблиця 2 та рис. 5e, f).Останнє може бути пов’язане з наявністю внутрішньомолекулярних дисульфідних зв’язків29,47.Послідовно, коли дисульфідні зв’язки NTMiSp були відновлені, він утворив гідрогель після інкубації при 37°C протягом 10 хвилин (рис. 5e).На закінчення слід зазначити, що структурна гнучкість є важливим, але не єдиним критерієм утворення гелю з НТ.Іншим фактором, який може мати значення, є схильність до утворення амілоїдних фібрил, і аналіз із застосуванням бази даних застібки та алгоритму Вальца дійсно показав кореляцію між здатністю утворювати гелі та наявністю амілоїдогенних ділянок, а також ступенем прогнозованих ділянок. для формування стеричних блискавок.Існувала кореляція (додаткова таблиця 2 і додаткова рис. 9).
Здатність NT утворювати фібрили та гелі за сприятливих умов привела нас до гіпотези, що злиття NT з іншими білковими фрагментами все ще може утворювати гелі з повною функцією партнерів злиття.Щоб перевірити це, ми ввели зелений флуоресцентний білок (GFP) і пуриннуклеозидфосфорилазу (PNP) на С-кінці NT відповідно.Отримані злиті білки експресувалися в E. coli з дуже високим кінцевим виходом (150 мг/л і 256 мг/л культур у струшуваних колбах для His-NT-GFP і His-NT-PNP відповідно), що відповідає тому, що було показано для інших білків, злитих з NT Ref.30. Злиті білки His-NT-GFP (300 мг/мл) і His-NT-PNP (100 мг/мл) утворили гелі через 2 години та 6,5 години при 37°C, і, що важливо, фракція GFP залишилася незмінною.спостерігається після гелеутворення, при цьому >70% початкової інтенсивності флуоресценції залишається після гелеутворення (рис. 6а).Щоб виміряти активність PNP у розчинах і гелях his-NT-PNP, нам довелося розбавити злитий білок NT, оскільки ферментативна активність чистого препарату була за межами діапазону виявлення аналізу при концентраціях гелеутворення.Гель, утворений сумішшю, що містить 0,01 мг/мл His-NT-PNP і 100 мг/мл NT, зберігав 65% початкової ферментативної активності попередньо інкубованих зразків (рис. 6b).Гель залишався неушкодженим під час вимірювання (додатковий рис. 10).
a Відносна інтенсивність флуоресценції до та після гелеутворення His-NT-GFP (300 мг/мл) і перевернутого флакона, що містить гідрогель His-NT-GFP (300 мг/мл) у видимому та УФ-світлі.Точки показують індивідуальні вимірювання (n = 3), стовпчики похибок показують стандартне відхилення.Середнє значення показано в центрі смужок помилок.b Активність PNP була отримана шляхом флуорометричного аналізу з використанням розчинів і гелів, що складаються з NT (100 мг/мл) і суміші, що містить 0,01 мг/мл his-NT-PNP і 100 мг/мл новотайванських доларів.На вставці показано перевернутий флакон, що містить гідрогель, що містить His-NT-PNP (шкала 5 мм).
Тут ми повідомляємо про утворення гідрогелів з NT та інших рекомбінантних білків спидроїну шляхом інкубації розчину білка при 37 ° C (рис. 1).Показано, що гелеутворення пов’язане з перетворенням α-спіралей у β-шари та утворенням амілоїдоподібних фібрил (рис. 3 і 4).Цей висновок є несподіваним, оскільки NT — це згорнуті глобулярні пучки з п’ятьма спіралями, відомі своєю надзвичайно високою розчинністю та високою стабільністю при концентраціях >200 мг/мл при 4°C протягом кількох днів27.Крім того, NT легко повторно згортаються після теплової денатурації при низьких концентраціях білка в мкМ.Згідно з нашими результатами, для утворення фібрил потрібна комбінація концентрації білка >10 мг/мл і трохи підвищеної температури (рис. 1).Це узгоджується з ідеєю, що амілоїдні фібрили можуть утворюватися з глобулярно згорнутих білків, які знаходяться в частково розгорнутому стані внаслідок теплових коливань у фізіологічних умовах 48 .Приклади білків, які піддаються такому перетворенню, включають інсулін49,50, β2-мікроглобулін, транстиретин і лізоцим51,52,53.Хоча NT є ​​α-спіраль у своєму природному стані, приблизно 65% поліпептидного ланцюга сумісні з утворенням стеричної блискавки (рис. 4e) 45 .Оскільки мономер є динамічно мобільним46, він може піддавати ці потенційні амілоїдогенні ділянки при помірно підвищених температурах, а при високих концентраціях загального білка може досягати критичної концентрації для утворення амілоїдної фібрили54.Дотримуючись цих міркувань, ми виявили негативну кореляцію між концентрацією спідроїну та часом гелеутворення (рис. 1c), і якщо мономерна конформація NT стабілізується або мутаціями (NT*, His-NT-L6), або додаванням солі, це може запобігти утворення гідрогелів (рис. 5).
У більшості випадків амілоїдні фібрили зникають із розчину у вигляді осаду, але за певних умов вони можуть утворювати гідрогелі55,56,57.Фібрили, що утворюють гідрогель, зазвичай мають високе співвідношення сторін і утворюють стабільні тривимірні мережі через молекулярне сплутування55,58, що відповідає нашим результатам.Для утворення гідрогелю in vitro білки часто повністю або частково розгортаються, наприклад, під впливом органічних розчинників, високої температури (70–90°C) та/або низького pH (1,5–3,0)59,60,61,62.Гідрогелі спидроїну, описані тут, не вимагають жорсткої обробки, а також не потребують зшиваючих агентів для стабілізації гідрогелів.
Раніше повідомлялося, що спідроїнові повтори та квантові точки, які, здається, піддаються перемиканню β-листів під час прядіння шовку, утворюють гідрогелі.Порівняно з нашими висновками, час інкубації та/або температури інкубації були значно довшими або вищими, відповідно, і отримані гідрогелі часто були непрозорими (Рисунок 7 і Додаткова таблиця 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. На додаток до швидкого гелеутворення, гідрогелі NT >300 мг/мл (30%) перевершували всі інші описані рекомбінантні гідрогелі протеїну павутинного шовку, а також природні гідрогелі, такі як желатин, альгінат (2%), агар (0,5% ) і колаген.(0,6%) (рис. 7 і додаткові таблиці 1 і 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Час утворення гелю та модуль пружності гідрогелів у цьому дослідженні порівнювали з іншими гідрогелями на основі спідроїну та вибраними природними гідрогелями.Посилання наведено разом з описом умов гелеутворення.APS Персульфат амонію, кімнатна температура.Дані 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Схоже, що павуки розробили способи запобігання гелеутворення спидроїну під час зберігання.Незважаючи на високу концентрацію білка в шовковій залозі, велика повторювана область, пов’язана з кінцевим доменом, означає, що видима концентрація NT і CT у залозі відповідає приблизно 10-20 мг/мл на межі цього дослідження.необхідні для спостережуваного утворення гідрогелю in vitro.Крім того, аналогічні концентрації солей 16 стабілізували NT, як у шовкових залозах (рис. 5b).Конформацію NT було вивчено в цитозолі E. coli та виявлено, що вона більш щільно згорнута, ніж при дослідженні in vitro, що додатково вказує на те, що сіль або інші фактори перешкоджають її агрегації in vivo.Однак здатність NT перетворюватися на фібрили β-листів може бути важливою для формування ниток і повинна бути досліджена в майбутніх дослідженнях.
На додаток до нових аспектів утворення NT-амілоїдних фібрил і гідрогелів, які спостерігаються в цьому дослідженні, ми також показуємо, що це явище може мати біотехнологічне та біомедичне застосування (рис. 8).Як доказ концепції ми поєднали NT з GFP або PNP і показали, що злитий білок також утворює гідрогелі при інкубації при 37 °C і що фракції GFP і PNP значною мірою зберігають свою активність після гелеутворення (рис. 6).Нуклеозидфосфорилази є важливими каталізаторами синтезу нуклеозидних аналогів75, що робить наше відкриття актуальним для біофармацевтичної промисловості.Концепція експресії злитих білків, які утворюють прозорі гідрогелі за сприятливих умов, дозволяє створювати функціональні гідрогелі зі сприятливими властивостями для широкого спектру застосувань, таких як іммобілізація ферментів, контрольоване вивільнення ліків і тканинна інженерія.Крім того, NT і NT* є ефективними маркерами експресії30, що означає, що NT і його варіанти можна використовувати для високопродуктивного виробництва розчинних злитих білків і подальшого створення іммобілізованих цільових білків у 3D гідрогелях.
NT є розчинним, α-спіральним і стабільним при низьких концентраціях (мкМ) і 37°C.При тій же температурі, але при зростаючих концентраціях (>10 мг/мл) НТ утворює гелі, що складаються з амілоїдоподібних фібрил.Злиті білки NT також утворюють фібрилярні гелі з повністю функціональними фрагментами злиття, що дозволяє іммобілізувати різні білки в 3D гідрогелях за допомогою NT.Внизу: NT (PDB: 4FBS) та ілюстрації волоконних мереж і пов’язаних білкових структур (передбачено та не намальовано в масштабі, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Конструкції (див. Додаткову таблицю 4 для повного списку, включаючи послідовності амінокислот) були клоновані в плазміду pT7 і трансформовані в E. coli BL21 (DE3).E. coli, що містить сконструйовані плазміди, інокулюють у бульйон Luria з додаванням канаміцину (70 мг/л) і вирощують протягом ночі при 30°C і 250 об/хв.Культуру потім інокулюють 1/100 у середовище LB, що містить канаміцин, і культивують при 30°C і 110 об/хв, поки OD600 не досягне 0,8.Для досліджень ЯМР бактерії вирощували в мінімальному середовищі М9, що містило 2 г D-глюкози 13C (Aldrich) і 1 г хлориду амонію 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) для мічення білка ізотопами.Знизьте температуру до 20 градусів Цельсія та індукуйте експресію білка за допомогою 0,15 мМ ізопропілтіогалактопіранозиду (кінцева концентрація).Після експресії білка протягом ночі клітини збирали при 7278×g, 4°C протягом 20 хвилин.Осади клітин ресуспендували в 20 мМ Трис-HCl, pH 8, і заморожували до подальшого використання.Розморожені клітини лізували за допомогою розривника клітин (машини серії TS, Constant Systems Limited, Англія) при 30 кПа.Потім лізати центрифугували при 25000 g протягом 30 хвилин при 4°C.Для NTMiSp осад потім ресуспендували в 2 М сечовині, 20 мМ Трис-HCl, рН 8, і обробляли ультразвуком протягом 2 хв (2 с увімк./вимк., 65%), потім знову центрифугували при 25 000 xg, 4°C протягом 30 хв.Супернатант завантажували на колонку Ni-NTA, промивали 20 мМ Трис-HCl, 2 мМ імідазолу, рН 8, і, нарешті, білок елюювали 20 мМ Трис-HCl, 200 мМ імідазолу, рН 8. Для отримання NT2RepCT і NTCT, розщеплення тромбіну вводить сайт (ThrCleav) між His і NT.Сайти розщеплення тромбіну також присутні в His-NT-ThrCleav-2Rep (утворює 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (утворює NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (утворює CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (продукує NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (продукує NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (продукує NTF1Sp) і His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (продукує NTMiSp).Конструкції розщеплювали тромбіном (1:1000) і діалізували протягом ночі при 4°C з 20 мМ Tris-HCl, pH 8, використовуючи діалізну мембрану Spectra/Por з порогом молекулярної маси 6-8 кДа.Після діалізу розчин завантажують на колонку Ni-NTA і збирають витік, що містить цікавий білок.Концентрацію білка визначали шляхом вимірювання поглинання УФ-випромінювання при 280 нм з використанням коефіцієнта екстинкції кожного білка, за винятком NTF1Sp, який використовував аналіз Бредфорда згідно з протоколом виробника.Чистоту визначали електрофорезом у поліакриламідному гелі (4–20%) із SDS та фарбуванням кумасі блискучим синім.Білки концентрували за допомогою центрифужних фільтрів (VivaSpin 20, GE Healthcare) при 4000 x g з обмеженням молекулярної маси 10 кДа за 20-хвилинні цикли.
Розморозьте розчин білка та обережно піпеткою влийте 150 мкл у прозорий флакон із перегородкою об’ємом 1 мл (8 x 40 мм Thermo Scientific).Пробірки закривали та герметизували парафільмом, щоб запобігти випаровуванню.Зразки (n = 3) інкубували при 37°C або 60°C і періодично перевертали для спостереження за гелеутворенням.Зразки, які не стали гелем, інкубували щонайменше один тиждень.Зменшіть дисульфідні зв’язки NTMiSp за допомогою 10 мМ DTT на 10 мкМ білка.Щоб проаналізувати гелеутворення натуральних покриттів з шовку павука, павука шведського моста розрізали, дві головні ампуловані залози поміщали в 200 мкл 20 мМ трис-HCl буфера рН 8 і розрізали, щоб покриття відокремилося від залоз..Вміст залоз розчиняють у буфері, 50 мкл для визначення сухої маси (шляхом інкубації відкритих флаконів при 60 °C до постійної маси) і 150 мкл для гелеутворення при 37 °C.
Вимірювальна геометрія/інструмент виготовлений з нержавіючої сталі з використанням паралельної пластини з верхнім діаметром 20 мм і зазором 0,5 мм.Нагрійте зразок від 25 °C до 45 °C і знову до 25 °C зі швидкістю 1 °C на хвилину за допомогою пластини Пельтьє з нержавіючої сталі.Вібраційні вимірювання проводили на частоті 0,1 Гц і в лінійній в’язкопружній області матеріалу при деформації 5% і 0,5% для зразків 100 мг/мл і 300–500 мг/мл відповідно.Використовуйте спеціальну камеру вологості, щоб запобігти випаровуванню.Дані аналізували за допомогою Prism 9.
Для збору інфрачервоних (ІЧ) спектрів при кімнатній температурі від 800 до 3900 см–1.Пристрій ATR, а також світловий шлях через спектрометр продувається сухим фільтрованим повітрям до та під час експерименту.Розчини (500 мг/мл для мінімізації піків поглинання води в спектрах) наносили піпеткою на кристали, а гелі (500 мг/мл) формували перед вимірюванням і потім переносили в кристали (n = 3).Було записано 1000 сканувань з роздільною здатністю 2 см-1 і нульовим робочим циклом 2. Друга похідна була розрахована за допомогою OPUS (Bruker) з використанням діапазону згладжування в дев’ять точок.Спектри були нормалізовані до тієї самої області інтеграції між 1720 і 1580 см-1 за допомогою F. Menges “Spectragryph – Optical Spectroscopy Software”.У спектроскопії ATR-IR глибина проникнення інфрачервоного променя в зразок залежить від хвильового числа, що призводить до більш сильного поглинання при нижчих хвильових числах, ніж при більших хвильових числах.Ці ефекти не були скориговані для спектрів, показаних на рис.3, тому що вони дуже малі (додатковий рис. 4).Скориговані спектри для цієї фігури були розраховані за допомогою програмного забезпечення Bruker OPUS.
В принципі, повна кількісна оцінка конформацій білків можлива після надійної деконволюції компонентів у межах піку аміду I.Однак на практиці виникають деякі перешкоди.Шум у спектрі може проявлятися як (помилкові) піки під час деконволюції.Крім того, пік через вигин води збігається з положенням піку аміду I і може мати аналогічну величину для зразків, що містять велику кількість води, таких як водний гель, який досліджується тут.Тому ми не намагалися повністю розкласти пік аміду I, і наші спостереження слід розглядати лише на підтримку інших методів, таких як ЯМР-спектроскопія.
Розчини 50 мг/мл NT і His-NT2RepCT гелеутворювали протягом ночі при 37°C.Потім гідрогель розбавляли 20 мМ Tris-HCl (pH 8) до концентрації 12,5 мг/мл, добре струшували та піпетували, щоб розбити гель.Потім гідрогель розбавляли в 10 разів 20 мМ Tris-HCl (pH 8), 5 мкл зразка наносили на мідну сітку, покриту формаваром, і надлишок зразка видаляли промокальним папером.Зразки двічі промивали 5 мкл води MilliQ і фарбували 1% уранілформіатом протягом 5 хвилин.Видаліть надлишки плями абсорбуючим папером, а потім висушіть сітку на повітрі.Зображення проводили на цих сітках за допомогою FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN, що працює при 100 кВ.Зображення були записані зі збільшенням х 26 500 і х 43 000 за допомогою камери CCD Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Мюнстер, Німеччина).Для кожного зразка (n = 1) записували 10–15 зображень.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) використовувався для аналізу зображень і вимірювання діаметрів волокон (n = 100, різні волокна).Призма 9 була використана для виконання непарних t-тестів (двосторонніх).Середні фібрили His-NT2RepCT і NT становили 11,43 (SD 2,035) і 7,67 (SD 1,389) нм відповідно.Довірчий інтервал (95%) становить від -4,246 до -3,275.ступені свободи = 198, p < 0,0001.
80 мкл рідких зразків, що містять 10 мкМ тіофлавіну Т (ThT), вимірювали в трьох повторах (n = 3) у статичних умовах, використовуючи 96-лункові планшети Corning з чорним дном і прозорим дном (Corning Glass 3881, США).Відмінності флуоресценції реєстрували за допомогою фільтра збудження 440 нм і емісійного фільтра 480 нм (FLUOStar Galaxy від BMG Labtech, Оффенбург, Німеччина).Сигнал ThT не був ні насиченим, ні погашеним, оскільки експерименти з різними концентраціями ThT проводилися без зміни інтенсивності сигналу.Запишіть поглинання при 360 нм для вимірювання матовості.Для експериментів із засіванням гелі 100 мг/мл утворювали при 37°C, ресуспендували та використовували для засівання при молярних співвідношеннях 5%, 10% та 20%.Дані аналізували за допомогою Prism 9.
Розморожуйте запаси His-NT2RepCT і NT >100 мг/мл на льоду та фільтруйте через фільтр 0,22 мкм.Концентрації були розраховані шляхом вимірювання абсорбції при 280 нм за допомогою Nanodrop.У лунках 96-лункового чорного незв’язувального планшета (Corning) з прозорим дном зразки розводили до 20 мг/мл у 20 мМ Tris-HCl pH 8 і змішували з 5 мкМ ThT (кінцева концентрація), загальною концентрацією зразка Об'єм 50 мкл.Зразки знімали кожні 10 хвилин при 37 °C на мікроскопі CellObserver (Zeiss) з каналом пропускання світла та наборами фільтрів збудження та випромінювання FITC для візуалізації ThT.Для отримання зображень використовується об’єктив 20x/0,4.Для аналізу зображень використовували Zen Blue (Zeiss) і ImageJ (https://imagej.nih.gov/).Гелі також готували з розчинів NT і His-NT2RepCT у концентрації 50 мг/мл, що містили 20 мМ Tris pH 8 і 5 мкМ ThT, і інкубували при 37°C протягом 90 хв.Шматочки гелю переносили в нову лунку, що містила 20 мМ Трис, рН 8 і 5 мкМ ThT у незв’язуючому чорному 96-лунковому планшеті з прозорим дном.Отримайте зображення зеленої флуоресценції та світлого поля зі збільшенням 20x/0,4.ImageJ використовувався для аналізу зображень.
Спектри ЯМР розчину були отримані при 310 К на спектрометрі Bruker Avance Neo 600 МГц, обладнаному QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).Зразки ЯМР, що містять 10 мг/мл гомогенного білка, міченого 13C, 15N, розчиненого в 20 мМ Tris-HCl (pH 8), 0,02% (мас./об.) NaN3, 5% DO (об./об.), (n = 1) .Хімічні зрушення NT2RepCT при pH 6,7 використовували для визначення піку 23 у 2D-спектрі 15N-HSQC.
Спектри ядерно-магнітного магнітно-магнітного резонансу (MAS) 13C, 15N-мічених гідрогелів під магічним кутом обертання були записані на спектрометрі Bruker Avance III HD при 800 МГц, обладнаному безелектронним зондом 3,2 мм 13C/15N{1H}.Температуру зразка контролювали за допомогою потоку газу зі змінною температурою при 277 К. Спектри двовимірного дипольного обертального резонансу (DARR)76 і радіочастотного перез’єднання (RFDR)77 були отримані на частотах MAS 12,5 кГц і 20 кГц відповідно.Перехресна поляризація (CP) від 1H до 13C була виконана з використанням лінійного зміни від 60,0 до 48,0 кГц при 1H, 61,3/71,6 кГц при 13C (при 12,5/20 кГц MAS) і часу контакту 0,5–1 мс.Під час збору даних було використано роз’єднання Spinal6478 на 73,5 кГц.Час отримання даних становив 10 мілісекунд, а затримка циклу становила 2,5 секунди.Однозв’язані Cα/Cβ кореляції, що спостерігаються в спектрах RFDR, були призначені на основі характерних хімічних зсувів залишкового типу та багатозв’язаних кореляцій у спектрах DARR.
База даних Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) була використана для оцінки тенденцій до флаттера та енергії Rosetta для NT, NTFlSp і NTMiSp.База даних Zipper обчислює Rosetta Energy80, яка поєднує кілька функцій вільної енергії для моделювання та аналізу структури білка.Рівень енергії -23 ккал/моль або нижче вказує на високу схильність до фібриляції.Нижча енергія означає більшу стабільність двох β-ланцюгів у конформації блискавки.Крім того, алгоритм Waltz використовувався для прогнозування амілоїдогенних ділянок у NT, NTFlSp і NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Розчин білка NT змішували з буфером 2-(N-морфоліно)етансульфонової кислоти (MES) при рН 5,5 і 6,0, щоб знизити рН до рН 6 і 7 відповідно.Кінцева концентрація білка становила 100 мг/мл.
Вимірювання проводили на спектрометрі J-1500 CD (JASCO, США) з використанням кювети об’ємом 300 мкл з оптичним шляхом 0,1 см.Білки розводили до 10 мкМ (n = 1) у 20 мМ фосфатному буфері (рН 8).Щоб проаналізувати стабільність білка в присутності солі, білки аналізували при тій самій концентрації (n = 1) у 20 мМ фосфатному буфері (pH 8), що містить 154 мМ NaF або NaCl відповідно.Сканування температури реєстрували при 222 нм від 25°C до 95°C зі швидкістю нагріву 1°C/хв.Частку нативно згорнутих білків розраховували за формулою (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Крім того, для кожного зразка було записано п'ять спектрів від 260 нм до 190 нм при 25°C і після нагрівання до 95°C.П'ять спектрів були усереднені, згладжені та перетворені в молярну еліптичність.Дані аналізували за допомогою Prism 9.
Інтенсивність флуоресценції His-NT-GFP (300 мг/мл, 80 мкл) вимірювали тричі (n = 3) у 96-лункових планшетах Corning з чорним прозорим дном (Corning Glass 3881, США) у статичних умовах.Виміряйте зразки за допомогою флуоресцентного планшетного зчитувача з довжиною хвилі збудження 395 нм і зафіксуйте випромінювання при 509 нм перед гелеутворенням і через 2 години при 37°C.Дані аналізувалися за допомогою Prism 9.
Набір для аналізу активності пуриннуклеозидфосфорилази (флуорометричний метод, Sigma Aldrich) використовували згідно з інструкціями виробника.Для вимірювання активності в гелях і розчинах, що містять His-NT-PNP, змішайте 10 нг His-NT-PNP зі 100 мг/мл NT до загального об’єму 2 мкл, оскільки гель давав сигнал вище інтервалу виявлення набору.Були включені контролі для гелів і розчинів без His-NT-PNP.Вимірювання проводили двічі (n = 2).Після вимірювання активності реакційну суміш видаляли, а гель фотографували, щоб переконатися, що гель залишався неушкодженим під час вимірювання.Дані аналізували за допомогою Prism 9.
Щоб отримати додаткові відомості про дизайн дослідження, перегляньте анотацію дослідження Nature, посилання на яку наведено в цій статті.
На рис. 1 і 2 наведені вихідні дані.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f та 6, додаткові рис.3, додатковий рис.5a, d, додатковий рис.6 і додатковий рис.8. Дані Дані цього дослідження розміщені в базі даних Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Дані ЯМР, отримані в цьому дослідженні, були розміщені в репозиторії BMRBig під ідентифікатором запису bmrbig36.Структури GFP і PNP були взяті з PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. і Johansson, J. Прядіння штучного шовку павука.National Chemical.біологія.11, 309–315 (2015).
Babb, PL та ін.Геном Nephila clavipes підкреслює різноманітність генів павутинного шовку та їх складну експресію.National Genette.49, 895–903 (2017).